Няколко антитела вече се използват или се разработват като терапии за лечение на COVID-19.С появата на нови варианти на тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2) е важно да се предвиди дали те все още ще бъдат податливи на терапия с антитела.Starr et al.Използвана е библиотека с дрожди, която обхваща всички мутации в домейна на свързване на рецептора на SARS-CoV-2, които няма да нарушат силно свързването с рецептора на гостоприемника (ACE2), и картографира как тези мутации засягат трите основни анти-SARS-CoV -2 свързване на антитела.Тези цифри идентифицират мутации, които избягват свързването на антитялото, включително единични мутации, които избягват двете антитела в сместа от антитела на Regeneron.Много мутации, които избягват едно антитяло, се разпространяват в хората.
Антителата са потенциална терапия за лечение на тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2), но не е ясно дали вирусът се развива, за да избегне техния риск.Тук картографираме как всички мутации в рецепторния свързващ домейн на SARS-CoV-2 (RBD) влияят на свързването на коктейла REGN-COV2 с антитялото LY-CoV016.Тези пълни карти разкриха аминокиселинна мутация, която напълно избягва сместа REGN-COV2, която е съставена от две антитела REGN10933 и REGN10987, които са насочени към различни структурни епитопи.Тези цифри също така идентифицират вирусни мутации, избрани при персистиращо инфектирани пациенти, лекувани с REGN-COV2 и по време на in vitro селекция за избягване на вируса.И накрая, тези цифри разкриват, че мутации, които избягват едно антитяло, вече присъстват в циркулиращите щамове SARS-CoV-2.Тези пълни карти за бягство могат да обяснят последствията от мутациите, наблюдавани по време на наблюдението на вируса.
Разработват се антитела за лечение на тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2) (1).Антителата срещу някои други вируси могат да бъдат направени неефективни от вирусни мутации, избрани по време на лечението на заразени пациенти (2, 3) или вирусни мутации, които са се разпространили в световен мащаб, за да придадат резистентност на целия вирусен клас.Следователно определянето кои мутации на SARS-CoV-2 могат да избягат от ключови антитела е от решаващо значение за оценка на това как мутациите, наблюдавани по време на наблюдението на вируса, влияят върху ефективността на терапията с антитела.
Повечето водещи анти-SARS-CoV-2 антитела са насочени към вирусния рецепторен свързващ домен (RBD), който медиира свързването към рецептора на ангиотензин конвертиращия ензим 2 (ACE2) (5, 6).Наскоро разработихме метод за дълбоко сканиране на мутации, за да картографираме как всички мутации на RBD засягат неговата функция и разпознаване от антивирусни антитела (7, 8).Методът включва създаване на библиотека от RBD мутанти, експресирането им на повърхността на дрожди и използване на активирано от флуоресценция клетъчно сортиране и дълбоко секвениране, за да се определи количествено как всяка мутация влияе върху RBD сгъването, ACE2 афинитета (измерен в серия от титриране) и свързването на антитяло (Фигура S1A).В това изследване използвахме повтарящата се мутантна библиотека, описана в (7), която е съставена от баркодирани RBD варианти, покриващи 3804 от 3819 възможни аминокиселинни мутации.Нашата библиотека беше подготвена от генетичния фон на RBD на ранния изолат Wuhan-Hu-1.Въпреки че честотата на няколко мутанта се увеличава, те все още представляват най-често срещаните RBD последователности (9, 10).Начертахме две от 2034 мутации, които не нарушават силно сгъването на RBD и свързването на ACE (7) как да предадем REGN-COV2 коктейла (REGN10933 и REGN10987) (11, 12) и LY-CoV016 на Eli Lilly. Рекомбинантната форма на антитялото засяга метода на свързване на антитялото (наричано още CB6 или JS016) (13) (Фигура S1B).REGN-COV2 наскоро получи разрешение за спешна употреба за COVID-19 (14), докато LY-CoV016 в момента преминава фаза 3 на клинични изпитвания (15).
[Glu406→Trp(E406W)] силно избягва сместа от две антитела (Фигура 1А).Картата за бягство на LY-CoV016 също разкри много мутации за бягство на различни места в RBD (Фигура 1B).Въпреки че някои избягващи мутации могат да нарушат способността на RBD да се свързва с ACE2 или да експресира в подходящо сгъната форма, според предишни измервания на сканиране на дълбоки мутации с използване на RBD, показан с дрожди, много функционални мутации имат малък или никакъв ефект върху тези функционални свойства (7 ) (Фигура 1, A и B представляват загубата на афинитет към ACE2, докато Фигура S2 представя намаляването на експресията на RBD.
(A) Картиране на антитялото в REGN-COV2.Линейната графика вляво показва избягването на всяко място в RBD (сумата от всички мутации на всяко място).Изображението на логото вдясно показва силното място за бягство (лилаво подчертано).Височината на всяка буква е пропорционална на силата на бягството, медиирано от мутацията на аминокиселината, и „резултат за бягство“ от 1 за всяка мутация съответства на пълно бягство.Скалата на оста y е различна за всеки ред, така че, например, E406W избягва всички REGN антитела, но това е най-очевидно за коктейли, тъй като е затрупано от другите места за бягство на отделните антитела.За мащабируемата версия S2, A и B се използват за оцветяване на картата според това как мутациите влияят на изразяването на сгънат RBD.S2, C и D се използват за разпределяне на влиянието върху афинитета на ACE2 и експресията на RBD сред всички мутации, наблюдавани в циркулиращи вирусни изолати.(B) Както е показано в (A), нарисувайте LY-CoV016.(C) Използвайте шипове-псевдотипирани лентивирусни частици, за да проверите ключови мутации в неутрализационния анализ.Избрахме да проверим мутациите, за които се предвижда да имат по-голямо въздействие или да съществуват с висока честота в изолатите на SARS-CoV-2 (като N439K) в кръвообращението.Всяка точка представлява кратното увеличение на средната инхибиторна концентрация (IC50) на мутацията спрямо пика на немутиралия див тип (WT), съдържащ D614G.Синята пунктирана линия 1 представлява ефект на неутрализация, подобен на WT, а стойност > 1 представлява повишена устойчивост на неутрализация.Цветът на точката показва дали искате да избягате от картата.Точките показват, че тъй като IC50 е извън използваната серия на разреждане, многократната промяна се проверява (горна или долна граница).Повечето мутанти се тестват в два екземпляра, така че има две точки.Пълната неутрализационна крива е показана на фигура 2. S3.Еднобуквените съкращения на аминокиселинните остатъци са както следва: A, Ala;С, цистеин;D, Asp;Е, Glu;F, Phe;G, Gly;H, неговият;аз, Иле;К, лизин;L, Лю;Митрополия Н, Асен;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;Т, Thr;V, Вал;W, триптофан;и Y, Tyr.
За да проверим антигенния ефект на ключовите мутации, ние проведохме неутрализационен анализ, използвайки лентивирусни частици с псевдотип на метличка, и открихме, че има съответствие между картата за избягване на свързването на антитялото и неутрализационния анализ (Фигура 1C и Фигура S3).Както се очаква от картата на антитялото REGN-COV2, мутацията на позиция 486 се неутрализира само от REGN10933, докато мутацията на позиции 439 и 444 се неутрализира само от REGN10987, така че тези мутации не могат да избягат.Но E406W е избягал от двете REGN-COV2 антитела, така че също е избягал силно от сместа.Чрез структурен анализ и селекция за избягване на вируса, Regeneron вярва, че нито една аминокиселинна мутация не може да избегне двете антитела в коктейла (11, 12), но нашата пълна карта идентифицира E406W като мутация за избягване на коктейл.E406W засяга антитялото REGN-COV2 по сравнително специфичен начин и не пречи сериозно на функцията на RBD, тъй като само леко намалява неутрализиращия ефект на LY-CoV016 (Фигура 1C) и титъра на шипове псевдотипирани лентивирусни частици ( Фигура S3F).
За да проучим дали нашата карта за бягство е в съответствие с еволюцията на вирусите при селекция на антитела, ние първо проверихме данните от експеримента за селекция на бягство от вируса на Regeneron, в който експресионният пик се отглежда в клетъчна култура в присъствието на REGN10933 везикуларен вирус на стоматит (VSV), REGN10987 или REGN-COV2 коктейл (12).Тази работа идентифицира пет евакуационни мутации от REGN10933, две евакуационни мутации от REGN10987 и никакви мутации от коктейл (Фигура 2А).Мутациите, избрани от всичките седем клетъчни култури, са подчертани в нашата карта за бягство и еднонуклеотидната промяна на дивия тип кодон в Wuhan-Hu-1 RBD последователността също е достъпна (Фигура 2B), показваща разликата между бягствата Concordance графика и еволюция на вируса под натиск на антитела в клетъчна култура.Струва си да се отбележи, че E406W не може да бъде достъпен чрез единични нуклеотидни промени, което може да обясни защо изборът на коктейл Regeneron не може да го идентифицира въпреки сравнително добрата поносимост на RBD сгъването и афинитета на ACE2.
(A) В присъствието на антитела, Regeneron използва псевдотип VSV на метлица, за да селектира мутациите за избягване на вируса в клетъчната култура (12).(B) Евакуативната диаграма, както е показано на фигура 1A, но показва само мутациите, достъпни чрез промяна на единичен нуклеотид в последователността Wuhan-Hu-1.Несивото показва мутации в клетъчна култура (червено) и инфектирани пациенти (синьо)), или и двете (лилаво).Фигура S5 показва тези графики, които са оцветени от това как мутациите влияят на афинитета на ACE2 или експресията на RBD.(C) Кинетика на RBD мутация при пациенти, лекувани с REGN-COV2 на 145-ия ден от инфекцията (черна пунктирана вертикална линия).Честотата на свързване между E484A и F486I се увеличи, но тъй като E484A не е мутация за избягване на нашата фигура, тя не е показана в други панели.Вижте също фигура.S4.(D) Изходните мутации, които се появяват в клетъчна култура и заразени пациенти, са достъпни чрез един нуклеотид и свързването на избягащите антитела не причинява големи разходи за афинитета на ACE2 [както е измерено чрез метода за показване на дрожди (7)].Всяка точка е мутация и нейната форма и цвят показват дали може да бъде достъпна и избрана по време на растежа на вируса.По-десните точки на оста х показват по-силно избягване на свързването на антитялото;по-високите точки на у-оста показват по-висок афинитет към ACE2.
За да определим дали Escape Atlas може да анализира еволюцията на вирусите, заразяващи хората, ние изследвахме данни от дълбоко секвениране от постоянно инфектиран имунокомпрометиран пациент, който е получил REGN-COV2 на 145-ия ден след диагностицирането на лечението с COVID-19 (16).Късното лечение позволява на вирусната популация на пациента да натрупа генетично разнообразие, част от което може да се дължи на имунен стрес, тъй като пациентът има слаб отговор на автонеутрализиращи антитела преди лечението (16).След прилагане на REGN-COV2, честотата на пет аминокиселинни мутации в RBD се променя бързо (Фигура 2C и Фигура S4).Нашата карта за бягство показа, че три от тези мутации са избягали от REGN10933 и една е избягала от REGN10987 (Фигура 2B).Струва си да се отбележи, че след лечението с антитяло не всички мутации са прехвърлени към фиксираното място.Напротив, има възход и спад на конкуренцията (Фигура 2C).Този модел е наблюдаван във вътрешната еволюция на адаптивните гостоприемници на други вируси (17, 18), вероятно поради конкуренцията между генетично свободно каране и вирусни линии.И двете от тези сили изглежда играят роля при пациенти с персистираща инфекция (Фигура 2C и Фигура S4C): E484A (не е евакуираща мутация в нашата диаграма) и F486I (избягаща REGN10933) свободна езда след лечение и вирусни линии, носещи N440D И Q493K (съответно избягал от REGN10987 и REGN10933) първо се конкурира с REGN10933 избягал мутант Y489H и след това се конкурира с линията, носеща E484A и F486I и Q493K.
Три от четирите избягващи мутации при пациенти, лекувани с REGN-COV2, не са идентифицирани в селекцията на вирусна клетъчна култура на Regeneron (Фигура 2B), което илюстрира предимството на пълната карта.Изборът на вируси е непълен, тъй като те могат да идентифицират само произволно избрани мутации в конкретния експеримент с клетъчна култура.Напротив, пълната карта анотира всички мутации, които могат да включват мутации, причинени от причини, които не са свързани с лечението, но случайно засягат свързването на антитялото.
Разбира се, еволюцията на вирусите се влияе от функционални ограничения и натиск за избягване на антитела.Мутациите и пациентите, избрани в клетъчна култура, винаги отговарят на следните критерии: те избягват свързването на антитялото, могат да навлязат чрез единична нуклеотидна промяна и имат малко или никакви разходи за афинитета на ACE2 [чрез предишните дълбоки мутации, показани с помощта на измерване на сканиране на дрожди RBD (7 )] (Фигура 2D и Фигура S5).Следователно, пълна карта на това как мутациите засягат ключови биохимични фенотипове на RBD (като ACE и свързване на антитяло) може да се използва за оценка на възможните пътища за еволюция на вируса.Едно предупреждение е, че в по-дълга еволюционна времева рамка, както се наблюдава при вирусния имунитет и избягването на лекарства, поради епистатични взаимодействия, толерантното пространство за мутации може да се промени (19-21).
Пълната карта ни позволява да оценим съществуващите евакуационни мутации в циркулиращия SARS-CoV-2.Проверихме всички налични последователности на SARS-CoV-2, получени от човека, към 11 януари 2021 г. и открихме, че голям брой RBD мутации са избягали от едно или повече антитела (Фигура 3).Обаче, единствената избягваща мутация, присъстваща в >0,1% от последователността, е REGN10933 избягващ мутант Y453F [0,3% от последователността;виж (12)], REGN10987 избягащ мутант N439K [1.7% от последователността;вижте Фигура 1C и (22)], и LY-CoV016 избягваща мутация K417N (0,1% последователност; вижте също Фигура 1C).Y453F се свързва с независими огнища, свързани с ферми за норки в Холандия и Дания (23, 24);заслужава да се отбележи, че самата последователност на норка понякога съдържа други мутации за избягване, като F486L (24).N439K е много популярен в Европа и представлява голяма част от последователността от Шотландия и Ирландия в Европа (22, 25).K417N съществува в линията B.1.351, открита за първи път в Южна Африка (10).Друга мутация, предизвикваща понастоящем безпокойство, е N501Y, която присъства в B.1.351, а също и в линията B.1.1.7, първоначално идентифицирана в Обединеното кралство (9).Нашата карта показва, че N501Y няма ефект върху антитялото REGN-COV2, но има само умерен ефект върху LY-CoV016 (Фигура 3).
За всяко антитяло или комбинация от антитела, към 11 януари 2021 г., сред 317 866 висококачествени последователности на SARS-CoV-2, получени от хора, на GISAID (26), връзката между резултата за избягване за всяка мутация и нейната честота.Маркирано е.Мутацията за избягване на коктейла REGN-COV2 E406W изисква множество нуклеотидни промени в последователността Wuhan-Hu-1 RBD и не се наблюдава в последователността GISAID.Други мутации на остатък E406 (E406Q и E406D) са наблюдавани с нискочестотно броене, но тези мутантни аминокиселини не са единични нуклеотидни мутации далеч от W.
Както се очаква, избягващите мутации обикновено се появяват в интерфейса антитяло-RBD.Въпреки това, структурата сама по себе си не е достатъчна, за да се предвиди кои мутации медиират бягството.Например, LY-CoV016 използва своите тежки и леки вериги, за да се свърже с широк епитоп, който припокрива повърхността на свързване на ACE2, но процесът на бягство включва мутации в RBD остатъци в региона, определящ комплементарността на тежката верига (Фигура 4A и Фигура S6, E до Ж).Обратно, бягствата от REGN10933 и REGN10987 се появяват главно в RBD остатъците, подредени на интерфейса на тежките и леките вериги на антитялото (Фигура 4A и Фигура S6, A до D).Мутацията E406W, която е избягала от сместа REGN-COV2, се появява при остатъци, които не са били в контакт с нито едно от антителата (Фигура 4, A и B).Въпреки че E406 е структурно по-близо до LY-CoV016 (Фигура 4B и Фигура S6H), мутацията E406W има много по-малък ефект върху антитялото (Фигура 1, B и C), което показва, че специфичният структурен механизъм на далечни разстояния е анти-REGN - COV2 антитяло (Фигура S6I).В обобщение, мутациите в RBD остатъци в контакт с антитела не винаги медиират бягство и някои значителни мутации на бягство възникват при остатъци, които не са в контакт с антитела (Фигура 4B и Фигура S6, D и G).
(A) Диаграмата за бягство, проектирана върху RBD структурата, свързана от антитялото.[REGN10933 и REGN10987: База данни за протеини (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].Променливите домени на тежките и леките вериги на антитялото са показани като сини карикатури, а цветът на повърхността на RBD показва силата на медиираното от мутация бягство на това място (бялото показва липса на бягство, а червеното показва най-силното място на излизане от антитялото или сместа).Сайтовете, които не са функционално мутирани, са оцветени в сиво.(B) За всяко антитяло класифицирайте мястото като директен контакт с антитяло (неводородни атоми в рамките на 4Å от антитялото), проксимално антитяло (4 до 8Å) или дистално антитяло (> 8Å).Всяка точка представлява сайт, разделен на бягство (червено) или не-бягство (черно).Сивата пунктирана линия представлява критичната стойност, използвана за класифициране на сайта като евакуационен или неуспешен (за подробности вижте Материали и методи).Червените и черните числа показват колко сайта във всяка категория са екранирани или неекранирани.
В това проучване ние напълно картографирахме мутациите, които избягват трите основни анти-SARS-CoV-2 антитела.Тези карти показват, че предишната характеристика на мутациите за бягство е непълна.Не са идентифицирани нито единични аминокиселинни мутации, които могат да избягат от двете антитела в коктейла REGN-COV2, нито са идентифицирали повечето пациенти с персистираща инфекция, лекувани с коктейла.мутация.Разбира се, нашата карта все още не е отговорила на най-неотложния въпрос: ще развие ли SARS-CoV-2 широка резистентност към тези антитела?Но това, което е сигурно е, че е тревожно, че толкова много мутации на избягване имат малък ефект върху сгъването на RBD или рецепторния афинитет и вече има някои мутации на ниско ниво в циркулиращите вируси.В крайна сметка е необходимо да се изчака и да се наблюдава какви мутации ще предаде SARS-CoV-2, когато се разпространи сред населението.Нашата работа ще подпомогне „наблюдението“, като незабавно обясни въздействието на мутациите, класифицирани чрез наблюдение на вирусния геном.
Това е статия със свободен достъп, разпространявана съгласно условията на Creative Commons Attribution License.Статията позволява неограничено използване, разпространение и възпроизвеждане във всеки носител, при условие че оригиналното произведение е правилно цитирано.
Забележка: Молим ви само да предоставите вашия имейл адрес, така че лицето, което препоръчвате на страницата, да знае, че искате да види имейла и че той не е спам.Няма да улавяме имейл адреси.
Този въпрос се използва, за да се провери дали сте посетител и да се предотврати автоматично изпращане на спам.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Пълната карта на мутациите на SARS-CoV-2, които избягват сместа от моноклонални антитела Regeneron, помага да се обясни еволюцията на вируса при лечението на пациенти.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Пълната карта на мутациите на SARS-CoV-2, които избягват сместа от моноклонални антитела Regeneron, помага да се обясни еволюцията на вируса при лечението на пациенти.
©2021 Американска асоциация за напредък на науката.всички права запазени.AAAS е партньор на HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Време на публикуване: 24 февруари 2021 г