Nekoliko antitijela je već u upotrebi ili je u razvoju kao terapija za liječenje COVID-19.S pojavom novih varijanti teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirusa 2 (SARS-CoV-2), važno je predvidjeti hoće li i dalje biti podložni terapiji antitijelima.Starr et al.Korištena je biblioteka kvasca koja pokriva sve mutacije u domeni vezivanja receptora SARS-CoV-2 koje neće snažno poremetiti vezivanje za receptor domaćina (ACE2) i mapirati kako ove mutacije utiču na tri glavna anti-SARS-CoV -2 vezivanje antitela.Ove brojke identificiraju mutacije koje izbjegavaju vezivanje antitijela, uključujući pojedinačne mutacije koje izbjegavaju dva antitijela u mješavini Regeneron antitijela.Mnoge mutacije koje izbjegnu jedno antitijelo šire se kod ljudi.
Antitijela su potencijalna terapija za liječenje teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirusa 2 (SARS-CoV-2), ali nije jasno da li se virus razvija kako bi izbjegao njihov rizik.Ovdje prikazujemo kako sve mutacije u domeni vezivanja receptora SARS-CoV-2 (RBD) utječu na vezivanje REGN-COV2 koktela za antitijelo LY-CoV016.Ove kompletne mape otkrile su mutaciju aminokiselina koja je potpuno izbjegla mješavinu REGN-COV2, koja se sastoji od dva antitijela REGN10933 i REGN10987 koja ciljaju različite strukturne epitope.Ove brojke također identificiraju mutacije virusa odabrane kod perzistentno inficiranih pacijenata liječenih REGN-COV2 i tokom in vitro selekcije virusa koji je pobjegao.Konačno, ove brojke otkrivaju da su mutacije koje izbjegnu jedno antitijelo već prisutne u cirkulirajućim sojevima SARS-CoV-2.Ove kompletne mape bijega mogu objasniti posljedice mutacija uočenih tokom nadzora virusa.
Razvijaju se antitijela za liječenje teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirusa 2 (SARS-CoV-2) (1).Antitijela protiv određenih drugih virusa mogu biti neefikasna zbog mutacija virusa odabranih tokom liječenja zaraženih pacijenata (2, 3) ili virusnih mutacija koje su se proširile globalno kako bi pružile otpornost cijeloj kladi virusa.Stoga je određivanje koje mutacije SARS-CoV-2 mogu izbjeći ključna antitijela ključno za procjenu kako mutacije uočene tokom nadzora virusa utiču na efikasnost terapije antitijelima.
Većina vodećih anti-SARS-CoV-2 antitela cilja na domen koji vezuje virusni receptor (RBD), koji posreduje u vezivanju za receptor enzima koji konvertuje angiotenzin 2 (ACE2) (5, 6).Nedavno smo razvili metodu dubokog skeniranja mutacija kako bismo mapirali kako sve mutacije RBD-a utječu na njegovu funkciju i prepoznavanje od strane antivirusnih antitijela (7, 8).Metoda uključuje kreiranje biblioteke RBD mutanata, njihovo izražavanje na površini kvasca i korištenje fluorescentno aktiviranog sortiranja stanica i dubokog sekvenciranja da se kvantifikuje kako svaka mutacija utječe na savijanje RBD, ACE2 afinitet (mjeren u seriji titracije) i vezivanje antitijela. (Slika S1A).U ovoj studiji koristili smo biblioteku repetitivnih mutanata opisanu u (7), koja se sastoji od barkodiranih RBD varijanti, koje pokrivaju 3804 od 3819 mogućih mutacija aminokiselina.Naša biblioteka je pripremljena iz RBD genetske pozadine ranog izolata Wuhan-Hu-1.Iako se učestalost nekoliko mutanata povećava, oni i dalje predstavljaju najčešće RBD sekvence (9, 10).Nacrtali smo dvije od 2034 mutacije koje ne remete snažno RBD savijanje i ACE vezivanje (7) kako proći REGN-COV2 koktel (REGN10933 i REGN10987) (11, 12) i Eli Lillyjev LY-CoV016 Rekombinantni oblik antitelo utiče na metod vezivanja antitela (takođe nazvan CB6 ili JS016) (13) (Slika S1B).REGN-COV2 je nedavno dobio odobrenje za hitnu upotrebu za COVID-19 (14), dok je LY-CoV016 trenutno u fazi kliničkih ispitivanja faze 3 (15).
[Glu406→Trp(E406W)] je snažno izbjegao mješavinu dva antitijela (slika 1A).Karta bijega LY-CoV016 također je otkrila mnoge mutacije bijega na različitim mjestima u RBD (Slika 1B).Iako neke escape mutacije mogu umanjiti sposobnost RBD-a da se veže na ACE2 ili da se ekspresije u odgovarajuće presavijenom obliku, prema prethodnim mjerenjima skeniranja dubokih mutacija korištenjem RBD-a prikazanog kvascem, mnoge funkcionalne mutacije imaju mali ili nikakav utjecaj na ova funkcionalna svojstva (7 ) (Slika 1, A i B predstavljaju gubitak ACE2 afiniteta, dok slika S2 predstavlja smanjenje ekspresije RBD.
(A) Mapiranje antitela u REGN-COV2.Linijski grafikon na lijevoj strani prikazuje bijeg na svakom mjestu u RBD (zbir svih mutacija na svakom mjestu).Slika logotipa na desnoj strani pokazuje snažnu lokaciju za bijeg (ljubičasta donja linija).Visina svakog slova je proporcionalna snazi bijega posredovanog mutacijom aminokiseline, a "skor bijega" od 1 za svaku mutaciju odgovara potpunom bijegu.Skala y-ose je drugačija za svaki red, tako da, na primjer, E406W izbjegava sva REGN antitijela, ali je najočitija za koktele jer je preopterećena drugim mjestima bijega pojedinačnih antitijela.Za skalabilnu verziju, S2, A i B se koriste za bojenje karte prema tome kako mutacije utječu na ekspresiju savijenog RBD-a.S2, C i D se koriste za raspodjelu utjecaja na ACE2 afinitet i ekspresiju RBD između svih mutacija uočenih u cirkulirajućim izolatima virusa.(B) Kao što je prikazano u (A), nacrtajte LY-CoV016.(C) Koristite lentivirusne čestice pseudotipizirane šiljcima da potvrdite ključne mutacije u testu neutralizacije.Odlučili smo provjeriti mutacije za koje se predviđa da će imati veći utjecaj ili će postojati na visokoj frekvenciji u izolatima SARS-CoV-2 (kao što je N439K) u cirkulaciji.Svaka tačka predstavlja višestruko povećanje medijane inhibitorne koncentracije (IC50) mutacije u odnosu na vrh nemutiranog divljeg tipa (WT) koji sadrži D614G.Plava isprekidana linija 1 predstavlja efekat neutralizacije sličan WT, a vrijednost> 1 predstavlja povećanu otpornost na neutralizaciju.Boja tačke označava da li želite da pobegnete sa mape.Tačke označavaju da se, budući da je IC50 izvan upotrijebljene serije razrjeđenja, provjerava višestruka promjena (gornja ili donja granica).Većina mutanata se testira u duplikatu, tako da postoje dvije točke.Kompletna kriva neutralizacije prikazana je na slici 2. S3.Jednoslovne skraćenice aminokiselinskih ostataka su sljedeće: A, Ala;C, cistein;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, njegov;I, Ile;K, lizin;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptofan;i Y, Tyr.
Kako bismo potvrdili antigenski učinak ključnih mutacija, izvršili smo test neutralizacije koristeći pseudotipizirane lentivirusne čestice metlice i otkrili da postoji konzistentnost između mape bijega vezivanja antitijela i testa neutralizacije (Slika 1C i Slika S3).Kao što se očekuje od karte antitijela REGN-COV2, mutaciju na poziciji 486 neutralizira samo REGN10933, dok je mutaciju na pozicijama 439 i 444 neutralizira samo REGN10987, tako da ove mutacije ne mogu pobjeći.Ali E406W je pobjegao od dva REGN-COV2 antitijela, tako da je također snažno pobjegao iz mješavine.Kroz strukturnu analizu i selekciju virusa koji je pobjegao, Regeneron vjeruje da nijedna mutacija aminokiselina ne može pobjeći dva antitijela u koktelu (11, 12), ali naša kompletna mapa identificira E406W kao mutaciju koja pobjegne od koktela.E406W utječe na REGN-COV2 antitijelo na relativno specifičan način i ne remeti ozbiljno funkciju RBD, jer samo neznatno smanjuje učinak neutralizacije LY-CoV016 (slika 1C) i titar šiljastih pseudotipiziranih lentivirusnih čestica (slika S3F).
Kako bismo istražili da li je naša escape mapa konzistentna s evolucijom virusa pod selekcijom antitijela, prvo smo provjerili podatke Regeneron eksperimenta selekcije virusa escape-a, u kojem je ekspresijski šiljak uzgojen u ćelijskoj kulturi u prisustvu bilo kojeg REGN10933 vezikularnog virus stomatitisa (VSV), REGN10987 ili REGN-COV2 koktel (12).Ovaj rad je identificirao pet escape mutacija iz REGN10933, dvije escape mutacije iz REGN10987 i nijednu mutaciju iz koktela (Slika 2A).Mutacije koje je odabralo svih sedam ćelijskih kultura istaknute su u našoj mapi bijega, a dostupna je i jednonukleotidna promjena kodona divljeg tipa u Wuhan-Hu-1 RBD sekvenci (Slika 2B), što ukazuje na razliku između escape-a Concordance graf i evolucija virusa pod pritiskom antitijela u ćelijskoj kulturi.Vrijedi napomenuti da se E406W ne može pristupiti promjenama pojedinačnih nukleotida, što može objasniti zašto selekcija Regeneron koktela ne može da ga identifikuje uprkos relativno dobroj toleranciji savijanja RBD i ACE2 afiniteta.
(A) U prisustvu antitijela, Regeneron koristi pseudotip metlice VSV da odabere mutacije koje pobjegnu virusu u ćelijskoj kulturi (12).(B) Dijagram bijega, kao što je prikazano na slici 1A, ali prikazuje samo mutacije dostupne jednom promjenom nukleotida u Wuhan-Hu-1 sekvenci.Ne-siva označava mutacije u ćelijskoj kulturi (crveno) i zaražene pacijente (plavo) ), ili oboje (ljubičasta).Slika S5 prikazuje ove grafikone, koji su obojeni kako mutacije utiču na ACE2 afinitet ili ekspresiju RBD.(C) Kinetika RBD mutacije kod pacijenata liječenih REGN-COV2 145. dana infekcije (crna tačkasta vertikalna linija).Učestalost povezivanja između E484A i F486I se povećala, ali budući da E484A nije mutacija na našoj slici, nije prikazana na drugim panelima.Vidi i sliku.S4.(D) Escape mutacije koje se javljaju u ćelijskoj kulturi i inficiranim pacijentima dostupne su jednim nukleotidom, a vezivanje escape antitijela ne uzrokuje nikakve veće troškove za ACE2 afinitet [kako se mjeri metodom prikaza kvasca (7)).Svaka tačka je mutacija, a njen oblik i boja ukazuju na to da li joj se može pristupiti i odabrati tokom rasta virusa.Više desnih tačaka na x-osi ukazuje na jače bijeg vezivanja antitijela;više tačke na y-osi ukazuju na veći ACE2 afinitet.
Kako bismo utvrdili može li Escape Atlas analizirati evoluciju virusa koji inficiraju ljude, ispitali smo podatke dubokog sekvenciranja od trajno zaraženog imunokompromitovanog pacijenta koji je primio REGN-COV2 145. dana nakon dijagnoze liječenja COVID-19 (16).Kasno liječenje omogućava pacijentovoj virusnoj populaciji da akumulira genetsku raznolikost, od kojih neke mogu biti uzrokovane imunološkim stresom, jer pacijent ima slab odgovor autoneutralizirajućih antitijela prije liječenja (16).Nakon primjene REGN-COV2, učestalost pet mutacija aminokiselina u RBD se brzo promijenila (Slika 2C i Slika S4).Naša escape mapa je pokazala da su tri od ovih mutacija pobjegle od REGN10933, a jedna od REGN10987 (slika 2B).Vrijedi napomenuti da nakon tretmana antitijelima nisu sve mutacije prebačene na fiksno mjesto.Naprotiv, postoji porast i pad konkurencije (slika 2C).Ovaj obrazac je uočen u unutrašnjoj evoluciji adaptivnih domaćina drugih virusa (17, 18), vjerovatno zbog nadmetanja između genetskih slobodnih i virusnih linija.Čini se da obje ove sile igraju ulogu kod pacijenata s perzistentnom infekcijom (slika 2C i slika S4C): E484A (nije escape mutacija u našem dijagramu) i F486I (escape REGN10933) koji slobodno jašu nakon tretmana, i virusne loze koje nose N440D i Q493K (koji je pobjegao od REGN10987 i REGN10933, respektivno) se prvo takmičio sa bežaćim mutantom REGN10933 Y489H, a zatim se takmičio sa lozom koja je nosila E484A i F486I i Q493K.
Tri od četiri escape mutacije kod pacijenata liječenih REGN-COV2 nisu identificirane u Regeneronovoj selekciji ćelijske kulture virusa (Slika 2B), što ilustruje prednost kompletne mape.Selekcija virusa je nepotpuna jer mogu identificirati samo sve mutacije koje su nasumično odabrane u konkretnom eksperimentu sa ćelijskom kulturom.Naprotiv, kompletna mapa označava sve mutacije, koje mogu uključivati mutacije uzrokovane razlozima koji nisu povezani s liječenjem, ali slučajno utiču na vezivanje antitijela.
Naravno, na evoluciju virusa utječu funkcionalna ograničenja i pritisak da se izbjegnu antitijela.Mutacije i pacijenti odabrani u ćelijskoj kulturi uvijek ispunjavaju sljedeće kriterije: izbjegavaju vezanje antitijela, mogu ući kroz jednu promjenu nukleotida i imaju malu ili nikakvu cijenu za ACE2 afinitet [preko prethodnih dubokih mutacija prikazanih pomoću mjerenja kvasca Skeniranje RBD (7 )] (Slika 2D i Slika S5).Stoga, kompletna mapa kako mutacije utječu na ključne biokemijske fenotipove RBD-a (kao što su ACE i vezivanje antitijela) može se koristiti za procjenu mogućih puteva za evoluciju virusa.Jedno upozorenje je da se u dužem evolucijskom vremenskom okviru, kao što je uočeno kod virusnog imuniteta i bijega lijeka, zbog epistatskih interakcija, prostor tolerancije za mutacije može promijeniti (19-21).
Kompletna mapa nam omogućava da procijenimo postojeće mutacije koje bježe u cirkulirajućem SARS-CoV-2.Provjerili smo sve dostupne sekvence SARS-CoV-2 dobivene od ljudi od 11. januara 2021. i otkrili da je veliki broj RBD mutacija izbjegao jedno ili više antitijela (Slika 3).Međutim, jedina escape mutacija prisutna u >0,1% sekvence je REGN10933 escape mutant Y453F [0,3% sekvence;vidi (12)], REGN10987 escape mutant N439K [1,7% sekvence;vidi slike 1C i (22)], i LY-CoV016 escape mutacija K417N (0,1% sekvenca; vidi takođe sliku 1C).Y453F je povezan sa nezavisnim epidemijama vezanim za farme minka u Holandiji i Danskoj (23, 24);Vrijedi napomenuti da sama sekvenca minka ponekad sadrži i druge mutacije bijega, kao što je F486L (24).N439K je veoma popularan u Evropi i čini veliki deo niza iz Škotske i Irske u Evropi (22, 25).K417N postoji u liniji B.1.351 koja je prvi put otkrivena u Južnoj Africi (10).Još jedna mutacija koja je trenutno zabrinjavajuća je N501Y, koja je prisutna u B.1.351 i također u B.1.1.7 lozi koja je prvobitno identificirana u UK (9).Naša mapa pokazuje da N501Y nema efekta na REGN-COV2 antitijelo, ali samo umjeren na LY-CoV016 (Slika 3).
Za svako antitijelo ili kombinaciju antitijela, od 11. januara 2021., među 317.866 visokokvalitetnih sekvenci SARS-CoV-2 koje su izvedene od ljudi na GISAID-u (26), odnos između rezultata bijega za svaku mutaciju i njene učestalosti.Označeno je.REGN-COV2 koktel escape mutacija E406W zahtijeva višestruke promjene nukleotida u Wuhan-Hu-1 RBD sekvenci i nije uočena u GISAID sekvenci.Druge mutacije ostatka E406 (E406Q i E406D) uočene su sa niskim frekvencijskim brojanjem, ali ove mutirane aminokiseline nisu mutacije pojedinačnih nukleotida daleko od W.
Kao što se i očekivalo, escape mutacije se obično javljaju u interfejsu antitijelo-RBD.Međutim, sama struktura nije dovoljna da se predvidi koje mutacije posreduju u bijegu.Na primjer, LY-CoV016 koristi svoje teške i lake lance da se veže za široki epitop koji preklapa površinu vezivanja ACE2, ali proces bijega uključuje mutacije u RBD ostacima u regiji koja određuje komplementarnost teškog lanca (Slika 4A i Slika S6, E do G).Nasuprot tome, bijeg od REGN10933 i REGN10987 uglavnom se dogodio na RBD ostacima naslaganim na granici teškog i lakog lanca antitijela (Slika 4A i Slika S6, A do D).Mutacija E406W koja je izbjegla smjesu REGN-COV2 dogodila se na ostacima koji nisu bili u kontaktu ni sa jednim antitijelom (Slika 4, A i B).Iako je E406 strukturno bliži LY-CoV016 (slika 4B i slika S6H), mutacija E406W ima mnogo manji učinak na antitijelo (slika 1, B i C), što ukazuje da je specifični strukturni mehanizam dugog dometa anti-REGN - COV2 antitelo (Slika S6I).Ukratko, mutacije na ostacima RBD u kontaktu s antitijelima ne posreduju uvijek u bijegu, a neke značajne mutacije bijega se javljaju na ostacima koji nisu u kontaktu s antitijelima (Slika 4B i Slika S6, D i G).
(A) Dijagram bijega projektiran na RBD strukturu vezanu antitijelom.[REGN10933 i REGN10987: Baza podataka proteina (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].Varijabilni domeni teških i lakih lanaca antitijela prikazani su kao plavi crtani filmovi, a boja na površini RBD-a ukazuje na snagu bijega posredovanog mutacijom na ovom mjestu (bijela označava da nema bijega, a crvena označava najjače mjesto bijega antitijela ili smjese).Web lokacije koje nisu funkcionalno mutirane su zasivljene.(B) Za svako antitelo klasifikujte mesto kao direktan kontakt sa antitelom (atomi koji nisu vodikovi unutar 4Å od antitela), proksimalno antitelo (4 do 8Å) ili distalno antitelo (> 8Å).Svaka tačka predstavlja lokaciju, podijeljenu na bijeg (crvena) ili ne-escape (crna).Siva isprekidana linija predstavlja kritičnu vrijednost koja se koristi za klasificiranje lokacije kao escape ili non-escape (za detalje pogledajte Materijali i metode).Crveni i crni brojevi označavaju koliko je lokacija u svakoj kategoriji izbjegnuto ili neotkriveno.
U ovoj studiji smo u potpunosti mapirali mutacije koje izbjegavaju tri glavna anti-SARS-CoV-2 antitijela.Ove mape ukazuju na to da je prethodna karakterizacija escape mutacija nepotpuna.Nisu identificirane niti pojedinačne mutacije aminokiselina koje mogu izbjeći dva antitijela u REGN-COV2 koktelu, niti je identificirana većina pacijenata s perzistentnom infekcijom liječenih koktelom.mutacija.Naravno, naša mapa još nije odgovorila na najhitnije pitanje: hoće li SARS-CoV-2 razviti opsežnu otpornost na ova antitijela?Ali ono što je sigurno je da je zabrinjavajuće da toliki broj escape mutacija ima mali učinak na savijanje RBD ili afinitet receptora, a već postoje neke mutacije niskog nivoa u cirkulirajućim virusima.Na kraju, potrebno je pričekati i promatrati koje će mutacije SARS-CoV-2 prenijeti kada se proširi među stanovništvom.Naš rad će pomoći „opažanju“ tako što će odmah objasniti uticaj mutacija klasifikovanih nadzorom virusnog genoma.
Ovo je članak otvorenog pristupa koji se distribuira pod uslovima licence Creative Commons Attribution.Članak dozvoljava neograničenu upotrebu, distribuciju i reprodukciju u bilo kom mediju pod uslovom da je originalno delo pravilno citirano.
Napomena: Od vas tražimo samo da navedete svoju adresu e-pošte kako bi osoba koju preporučite na stranici znala da želite da vidi e-poštu i da nije neželjena pošta.Nećemo uhvatiti nijednu adresu e-pošte.
Ovo pitanje se koristi za testiranje da li ste posjetitelj i sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Kompletna mapa SARS-CoV-2 mutacija koje izmiču Regeneron mješavini monoklonskih antitijela pomaže u objašnjenju evolucije virusa u liječenju pacijenata.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Kompletna mapa SARS-CoV-2 mutacija koje izmiču Regeneron mješavini monoklonskih antitijela pomaže u objašnjenju evolucije virusa u liječenju pacijenata.
©2021 Američko udruženje za unapređenje nauke.sva prava zadržana.AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Vrijeme objave: Feb-24-2021