Diversos anticossos ja estan en ús o en desenvolupament com a teràpies per al tractament de la COVID-19.Amb l'aparició de noves variants de la síndrome respiratòria aguda severa coronavirus 2 (SARS-CoV-2), és important predir si encara seran susceptibles a la teràpia amb anticossos.Starr et al.Es va utilitzar una biblioteca de llevats, que cobreix totes les mutacions del domini d'unió al receptor SARS-CoV-2 que no interrompran fortament la unió al receptor hoste (ACE2) i mapeja com aquestes mutacions afecten els tres principals anti-SARS-CoV. -2 unió d'anticossos.Aquestes xifres identifiquen mutacions que escapen a la unió d'anticossos, incloses les mutacions individuals que escapen dels dos anticossos de la barreja d'anticossos Regeneron.Moltes mutacions que escapen d'un sol anticòs s'estan estenent en humans.
Els anticossos són una teràpia potencial per al tractament de la síndrome respiratòria aguda severa coronavirus 2 (SARS-CoV-2), però no està clar que el virus es desenvolupi per escapar del seu risc.Aquí, mapem com totes les mutacions del domini d'unió al receptor SARS-CoV-2 (RBD) afecten la unió del còctel REGN-COV2 a l'anticòs LY-CoV016.Aquests mapes complets van revelar una mutació d'aminoàcids que va evadir completament la barreja REGN-COV2, que es compon de dos anticossos REGN10933 i REGN10987 que es dirigeixen a diferents epítops estructurals.Aquestes xifres també identifiquen mutacions de virus seleccionades en pacients persistentment infectats tractats amb REGN-COV2 i durant la selecció d'escapament de virus in vitro.Finalment, aquestes xifres revelen que les mutacions que escapen d'un sol anticòs ja estan presents a les soques circulants de SARS-CoV-2.Aquests mapes de fugida complets poden explicar les conseqüències de les mutacions observades durant la vigilància del virus.
S'estan desenvolupant anticossos per tractar la síndrome respiratòria aguda severa coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (1).Els anticossos contra alguns altres virus es poden fer ineficaços per mutacions de virus seleccionades durant el tractament de pacients infectats (2, 3) o mutacions virals que s'han estès globalment per conferir resistència a tot el clade del virus.Per tant, determinar quines mutacions SARS-CoV-2 poden escapar dels anticossos clau és fonamental per avaluar com les mutacions observades durant la vigilància del virus afecten l'eficàcia de la teràpia d'anticossos.
La majoria dels anticossos anti-SARS-CoV-2 dirigeixen el domini d'unió al receptor viral (RBD), que media la unió al receptor de l'enzim convertidor d'angiotensina 2 (ACE2) (5, 6).Recentment, hem desenvolupat un mètode d'exploració de mutacions profundes per mapejar com totes les mutacions de RBD afecten la seva funció i el reconeixement per anticossos antivirals (7, 8).El mètode consisteix a crear una biblioteca de mutants RBD, expressar-los a la superfície del llevat i utilitzar la classificació cel·lular activada per fluorescència i la seqüenciació profunda per quantificar com cada mutació afecta el plegament de RBD, l'afinitat ACE2 (mesurada en una sèrie de titulació) i la unió d'anticossos. (Figura S1A).En aquest estudi, hem utilitzat la biblioteca de mutants repetitius descrita a (7), que es compon de variants RBD amb codi de barres, que cobreix 3804 de les 3819 possibles mutacions d'aminoàcids.La nostra biblioteca es va preparar a partir del fons genètic RBD del primer aïllat Wuhan-Hu-1.Tot i que la freqüència de diversos mutants està augmentant, encara representen les seqüències RBD més comunes (9, 10).Hem dibuixat dues de les 2034 mutacions que no pertorben fortament el plegament RBD i la unió ACE (7) com passar el còctel REGN-COV2 (REGN10933 i REGN10987) (11, 12) i el LY-CoV016 d'Eli Lilly La forma recombinant del L'anticòs afecta el mètode d'unió d'anticossos (també anomenat CB6 o JS016) (13) (Figura S1B).Recentment, REGN-COV2 s'ha concedit una autorització d'ús d'emergència per a la COVID-19 (14), mentre que LY-CoV016 està en fase d'assaigs clínics de fase 3 (15).
[Glu406 → Trp (E406W)] va escapar fortament de la barreja de dos anticossos (figura 1A).El mapa d'escapament de LY-CoV016 també va revelar moltes mutacions d'escapament a diferents llocs de RBD (figura 1B).Tot i que algunes mutacions d'escapament poden perjudicar la capacitat de RBD d'unir-se a ACE2 o expressar-se en una forma adequadament plegada, segons mesures anteriors d'escaneig de mutacions profundes mitjançant RBD mostrat amb llevats, moltes mutacions funcionals tenen poc o cap efecte en aquestes propietats funcionals (7). ) (La figura 1, A i B representen la pèrdua de l'afinitat ACE2, mentre que la figura S2 representa la disminució de l'expressió RBD.
(A) Mapeig de l'anticossos a REGN-COV2.El gràfic de línies de l'esquerra mostra l'escapada a cada lloc del RBD (la suma de totes les mutacions a cada lloc).La imatge del logotip de la dreta mostra la ubicació d'escapada forta (subratllat morat).L'alçada de cada lletra és proporcional a la força de la fugida mediada per la mutació d'aminoàcids, i una "puntuació d'escapada" d'1 per a cada mutació correspon a una fugida completa.L'escala de l'eix y és diferent per a cada fila, de manera que, per exemple, E406W escapa de tots els anticossos REGN, però és més evident per als còctels perquè està aclaparat pels altres llocs d'escapament dels anticossos individuals.Per a la versió escalable, S2, A i B s'utilitzen per acolorir el mapa segons com les mutacions afecten l'expressió de RBD plegat.S2, C i D s'utilitzen per distribuir la influència sobre l'afinitat d'ACE2 i l'expressió RBD entre totes les mutacions observades en aïllats de virus circulants.(B) Com es mostra a (A), dibuixeu LY-CoV016.(C) Utilitzeu partícules lentivirals pseudotipades amb puntes per verificar mutacions clau en l'assaig de neutralització.Vam optar per verificar les mutacions que es preveu que tinguin un impacte més gran o que existeixin a una freqüència elevada en aïllats de SARS-CoV-2 (com ara N439K) a la circulació.Cada punt representa l'augment de vegades de la concentració inhibidora mitjana (IC50) de la mutació en relació amb el pic del tipus salvatge no mutat (WT) que conté D614G.La línia discontínua blava 1 representa un efecte de neutralització similar al WT, i un valor> 1 representa una resistència de neutralització augmentada.El color del punt indica si voleu escapar del mapa.Els punts indiquen que com que l'IC50 es troba fora de la sèrie de dilucions utilitzada, es comprova el canvi múltiple (límit superior o inferior).La majoria de mutants es proveen per duplicat, de manera que hi ha dos punts.La corba de neutralització completa es mostra a la figura 2. S3.Les abreviatures d'una lletra dels residus d'aminoàcids són les següents: A, Ala;C, cisteïna;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, la seva;jo, Ile;K, lisina;L, Liu;Metròpolis N, Assen;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptòfan;i Y, Tyr.
Per verificar l'efecte antigènic de les mutacions clau, vam realitzar un assaig de neutralització mitjançant partícules lentivirals pseudotipades de panícula i vam trobar que hi havia una coherència entre el mapa d'escapada d'unió d'anticossos i l'assaig de neutralització (figura 1C i figura S3).Com s'esperava del mapa d'anticossos REGN-COV2, la mutació a la posició 486 només està neutralitzada per REGN10933, mentre que la mutació a les posicions 439 i 444 només està neutralitzada per REGN10987, de manera que aquestes mutacions no poden escapar.Però E406W va escapar dels dos anticossos REGN-COV2, de manera que també va escapar de la barreja amb força.Mitjançant l'anàlisi estructural i la selecció d'escapament de virus, Regeneron creu que cap mutació d'aminoàcids pot escapar dels dos anticossos del còctel (11, 12), però el nostre mapa complet identifica E406W com una mutació d'escapament de còctel.E406W afecta l'anticòs REGN-COV2 d'una manera relativament específica i no interfereix seriosament amb la funció de RBD, ja que només redueix lleugerament l'efecte de neutralització de LY-CoV016 (figura 1C) i el títol de partícules lentivirals pseudotipades amb puntes (figura 1). S3F).
Per tal d'explorar si el nostre mapa d'escapament és coherent amb l'evolució dels virus sota la selecció d'anticossos, primer vam comprovar les dades de l'experiment de selecció d'escapament del virus Regeneron, en què l'espiga d'expressió es va fer créixer en cultiu cel·lular en presència de qualsevol REGN10933 El vesicular virus de l'estomatitis (VSV), REGN10987 o còctel REGN-COV2 (12).Aquest treball va identificar cinc mutacions d'escapament de REGN10933, dues mutacions d'escapament de REGN10987 i cap mutació del còctel (figura 2A).Les mutacions seleccionades pels set cultius cel·lulars es destaquen al nostre mapa d'escapament, i el canvi d'un sol nucleòtid del codó de tipus salvatge a la seqüència RBD de Wuhan-Hu-1 també és accessible (figura 2B), cosa que indica la diferència entre escapades. gràfic i evolució del virus sota pressió d'anticossos en cultiu cel·lular.Val la pena assenyalar que no es pot accedir a E406W mitjançant canvis de nucleòtids únics, cosa que pot explicar per què la selecció de còctels Regeneron no pot identificar-lo malgrat la relativa bona tolerància al plegament RBD i l'afinitat ACE2.
(A) En presència d'anticossos, Regeneron utilitza el pseudotipus de panícula VSV per seleccionar mutacions d'escapament del virus en cultiu cel·lular (12).(B) El diagrama d'escapament, tal com es mostra a la figura 1A, però només mostra les mutacions accessibles per un sol canvi de nucleòtids a la seqüència Wuhan-Hu-1.No gris indica mutacions en cultiu cel·lular (vermell) i pacients infectats (blau) ), o tots dos (morat).La figura S5 mostra aquests gràfics, que estan acolorits per com les mutacions afecten l'afinitat ACE2 o l'expressió RBD.(C) Cinètica de la mutació RBD en pacients tractats amb REGN-COV2 el 145è dia d'infecció (línia vertical de punts negres).La freqüència d'enllaç entre E484A i F486I va augmentar, però com que E484A no és una mutació d'escapament a la nostra figura, no es mostra en altres panells.Vegeu també la figura.S4.(D) Les mutacions d'escapament que es produeixen en cultius cel·lulars i pacients infectats són accessibles per un sol nucleòtid, i la unió d'anticossos d'escapament no causa cap cost important a l'afinitat ACE2 [tal com es mesura pel mètode de visualització de llevats (7)].Cada punt és una mutació, i la seva forma i color indiquen si es pot accedir i seleccionar-hi durant el creixement del virus.Els punts més a la dreta de l'eix x indiquen una fuga d'unió d'anticossos més forta;els punts més alts de l'eix y indiquen una afinitat ACE2 més alta.
Per tal de determinar si Escape Atlas pot analitzar l'evolució dels virus que infecten humans, vam examinar les dades de seqüenciació profunda d'un pacient immunodeprimit persistentment infectat que va rebre REGN-COV2 el dia 145 després del diagnòstic del tractament COVID-19 (16).El tractament tardà permet que la població vírica del pacient acumuli diversitat genètica, part de la qual pot ser impulsada per l'estrès immunitari, perquè el pacient té una resposta d'anticossos autoneutralitzants febles abans del tractament (16).Després de l'administració de REGN-COV2, la freqüència de cinc mutacions d'aminoàcids en RBD va canviar ràpidament (figura 2C i figura S4).El nostre mapa d'escapament va mostrar que tres d'aquestes mutacions van escapar de REGN10933 i una de REGN10987 (figura 2B).Val la pena assenyalar que després del tractament amb anticossos, no totes les mutacions es van transferir al lloc fix.Al contrari, hi ha l'augment i la caiguda de la competència (figura 2C).Aquest patró s'ha observat en l'evolució interna dels hostes adaptatius d'altres virus (17, 18), possiblement a causa de la competència entre llinatges genètics lliures i virals.Ambdues forces semblen tenir un paper en pacients amb infecció persistent (figura 2C i figura S4C): E484A (no és una mutació d'escapament al nostre diagrama) i F486I (escapament de REGN10933) en moviment lliure després del tractament i llinatges de virus que porten N440D i Q493K (escapant de REGN10987 i REGN10933, respectivament) va competir primer amb el mutant d'escapament REGN10933 Y489H, i després va competir amb el llinatge que portava E484A i F486I i Q493K.
Tres de les quatre mutacions d'escapament en pacients tractats amb REGN-COV2 no es van identificar a la selecció de cultiu cel·lular de virus de Regeneron (figura 2B), que il·lustra l'avantatge del mapa complet.La selecció de virus és incompleta perquè només poden identificar qualsevol mutació seleccionada aleatòriament en aquest experiment de cultiu cel·lular en particular.Al contrari, el mapa complet anota totes les mutacions, que poden incloure mutacions causades per motius no relacionats amb el tractament, però que afecten accidentalment la unió d'anticossos.
Per descomptat, l'evolució dels virus es veu afectada per les limitacions funcionals i la pressió per evadir els anticossos.Les mutacions i els pacients seleccionats en cultiu cel·lular sempre compleixen els criteris següents: escapen de la unió d'anticossos, poden entrar a través d'un sol canvi de nucleòtids i tenen poc o cap cost per a l'afinitat ACE2 [a través de les mutacions profundes anteriors que es mostren mitjançant la mesura d'escaneig de llevats RBD (7) )] (Figura 2D i Figura S5).Per tant, es pot utilitzar un mapa complet de com les mutacions afecten els fenotips bioquímics clau de RBD (com l'ACE i la unió d'anticossos) per avaluar possibles vies per a l'evolució del virus.Una advertència és que en un període de temps evolutiu més llarg, com s'observa en la immunitat viral i l'escapada de fàrmacs, a causa de les interaccions epistàtiques, l'espai de tolerància a les mutacions pot canviar (19-21).
El mapa complet ens permet avaluar les mutacions de fugida existents en el SARS-CoV-2 circulant.Vam comprovar totes les seqüències disponibles de SARS-CoV-2 derivades d'éssers humans a partir de l'11 de gener de 2021 i vam trobar que un gran nombre de mutacions RBD van escapar d'un o més anticossos (figura 3).Tanmateix, l'única mutació d'escapament present en > 0,1% de la seqüència és el mutant d'escapament REGN10933 Y453F [0,3% de la seqüència;vegeu (12)], REGN10987 escape mutant N439K [1,7% de la seqüència;vegeu la figura 1C i (22)], i la mutació d'escapada de LY-CoV016 K417N (seqüència del 0,1%; vegeu també la figura 1C).Y453F s'associa amb brots independents relacionats amb granges de visons als Països Baixos i Dinamarca (23, 24);val la pena assenyalar que la pròpia seqüència de visó de vegades conté altres mutacions d'escapament, com ara F486L (24).N439K és molt popular a Europa i constitueix una gran part de la seqüència d'Escòcia i Irlanda a Europa (22, 25).K417N existeix al llinatge B.1.351 descobert per primera vegada a Sud-àfrica (10).Una altra mutació de preocupació actual és N501Y, que està present a B.1.351 i també al llinatge B.1.1.7 identificat originalment al Regne Unit (9).El nostre mapa mostra que N501Y no té cap efecte sobre l'anticòs REGN-COV2, però només un efecte moderat sobre LY-CoV016 (figura 3).
Per a cada anticossos o combinació d'anticossos, a partir de l'11 de gener de 2021, entre les 317.866 seqüències SARS-CoV-2 d'alta qualitat derivades d'éssers humans a GISAID (26), la relació entre la puntuació d'escapament de cada mutació i la seva freqüència.Està marcat.La mutació d'escapada del còctel REGN-COV2 E406W requereix múltiples canvis de nucleòtids a la seqüència RBD Wuhan-Hu-1 i no s'observa a la seqüència GISAID.Es van observar altres mutacions del residu E406 (E406Q i E406D) amb un recompte de baixa freqüència, però aquests aminoàcids mutants no són mutacions d'un sol nucleòtid lluny de W.
Com era d'esperar, les mutacions d'escapament solen produir-se a la interfície anticossos-RBD.Tanmateix, l'estructura per si sola no és suficient per predir quines mutacions medien la fugida.Per exemple, LY-CoV016 utilitza les seves cadenes pesades i lleugeres per unir-se a un epítop ampli que se superposa a la superfície d'unió ACE2, però el procés d'escapament implica mutacions en residus RBD a la regió determinant de la complementarietat de la cadena pesada (figura 4A i figura S6, E a G).En canvi, les fuites de REGN10933 i REGN10987 es van produir principalment als residus de RBD apilats a la interfície de cadenes pesades i lleugeres d'anticossos (figura 4A i figura S6, A a D).La mutació E406W que va escapar de la barreja REGN-COV2 es va produir en residus que no estaven en contacte amb cap dels dos anticossos (figura 4, A i B).Tot i que E406 està estructuralment més a prop de LY-CoV016 (figura 4B i figura S6H), la mutació E406W té un efecte molt menor sobre l'anticossos (figura 1, B i C), cosa que indica que el mecanisme estructural específic de llarg abast és anti-REGN. - Anticòs COV2 (Figura S6I).En resum, les mutacions als residus de RBD en contacte amb anticossos no sempre medien la fugida, i algunes mutacions d'escapament significatives es produeixen als residus que no estan en contacte amb els anticossos (figura 4B i figura S6, D i G).
(A) El diagrama d'escapament projectat a l'estructura RBD unida per l'anticòs.[REGN10933 i REGN10987: ID de base de dades de proteïnes (PDB) 6XDG (11);LY-CoV016: ID PDB 7C01 (13)].Els dominis variables de les cadenes pesades i lleugeres de l'anticossos es mostren com a dibuixos animats blaus, i el color de la superfície del RBD indica la força de l'escapada mediada per la mutació en aquest lloc (el blanc indica que no hi ha escapada i el vermell indica la més forta). lloc d'escapament de l'anticossos o la barreja).Els llocs que no estan mutats funcionalment apareixen en gris.(B) Per a cada anticòs, classifiqueu el lloc com a contacte directe d'anticossos (àtoms no d'hidrogen dins de 4Å de l'anticòs), anticòs proximal (4 a 8Å) o anticòs distal (> 8Å).Cada punt representa un lloc, dividit en escape (vermell) o no escape (negre).La línia discontínua grisa representa el valor crític utilitzat per classificar el lloc com a escape o no (per obtenir més informació, vegeu Materials i mètodes).Els números vermells i negres indiquen quants llocs de cada categoria s'han escapat o no.
En aquest estudi, hem cartografiat completament les mutacions que evaden els tres principals anticossos anti-SARS-CoV-2.Aquests mapes indiquen que la caracterització prèvia de les mutacions d'escapament és incompleta.No s'han identificat mutacions d'aminoàcids únics que poden escapar dels dos anticossos del còctel REGN-COV2, ni s'han identificat la majoria de pacients amb infecció persistent tractats amb el còctel.mutació.Per descomptat, el nostre mapa encara no ha respost la pregunta més urgent: el SARS-CoV-2 desenvoluparà una gran resistència a aquests anticossos?Però el que és cert és que és preocupant que tantes mutacions d'escapament tinguin poc efecte sobre el plegament de RBD o l'afinitat del receptor, i ja hi ha algunes mutacions de baix nivell en els virus circulants.Al final, cal esperar i observar quines mutacions transmetrà el SARS-CoV-2 quan s'estengui entre la població.El nostre treball ajudarà a "l'observació" explicant immediatament l'impacte de les mutacions classificades per la vigilància del genoma viral.
Aquest és un article d'accés obert distribuït sota els termes de la llicència de reconeixement de Creative Commons.L'article permet l'ús, la distribució i la reproducció sense restriccions en qualsevol mitjà amb la condició que l'obra original sigui degudament citada.
Nota: només us demanem que proporcioneu la vostra adreça de correu electrònic perquè la persona que recomaneu a la pàgina sàpiga que voleu que vegi el correu electrònic i que no és correu brossa.No capturarem cap adreça de correu electrònic.
Aquesta pregunta s'utilitza per comprovar si sou un visitant i evitar l'enviament automàtic de correu brossa.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
El mapa complet de les mutacions SARS-CoV-2 que escapen de la barreja d'anticossos monoclonals de Regeneron ajuda a explicar l'evolució del virus en el tractament dels pacients.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
El mapa complet de les mutacions SARS-CoV-2 que escapen de la barreja d'anticossos monoclonals de Regeneron ajuda a explicar l'evolució del virus en el tractament dels pacients.
©2021 Associació Americana per a l'Avenç de la Ciència.tots els drets reservats.AAAS és soci de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Hora de publicació: 24-feb-2021