Diversi anticorpi sò digià in usu o in sviluppu cum'è terapie per u trattamentu di COVID-19.Cù l'emergenza di novi varianti di u sindromu respiratoriu agutu severu coronavirus 2 (SARS-CoV-2), hè impurtante predichendu s'ellu saranu sempre suscettibili à a terapia di anticorpi.Starr et al.Una biblioteca di levadura hè stata aduprata, chì copre tutte e mutazioni in u duminiu di ubligatoriu di u receptore SARS-CoV-2 chì ùn disturberà micca fermamente u ligame à u receptore di l'ospite (ACE2), è mappa cumu queste mutazioni affettanu i trè I principali anti-SARS-CoV. -2 ligame di l'anticorpi.Queste figure identificanu mutazioni chì scappanu di u ligame di l'anticorpi, cumprese mutazioni singuli chì scappanu i dui anticorpi in a mistura di anticorpi Regeneron.Parechje mutazioni chì scappanu di un unicu anticorpu si sparghjenu in l'omu.
L'anticorpi sò una terapia potenziale per u trattamentu di u sindromu respiratoriu agutu severu coronavirus 2 (SARS-CoV-2), ma ùn hè micca chjaru chì u virus si sviluppa per scappà u so risicu.Quì, cartografiamu cumu tutte e mutazioni in u duminiu di ubligatoriu di u receptore SARS-CoV-2 (RBD) affettanu u ligame di u cocktail REGN-COV2 à l'anticorpu LY-CoV016.Queste carte complete anu revelatu una mutazione di aminoacidu chì evade cumplettamente a mistura REGN-COV2, chì hè cumpostu di dui anticorpi REGN10933 è REGN10987 chì miranu à e diverse epitopi strutturali.Queste figure identificanu ancu mutazioni di virus selezziunate in i pazienti infettati persistenti trattati cù REGN-COV2 è durante a selezzione di fuga di virus in vitro.Infine, sti figuri revelanu chì e mutazioni chì scappanu di un unicu anticorpu sò digià prisenti in i ceppi SARS-CoV-2 circulanti.Queste carte di fuga cumplete ponu spiegà e cunsequenze di mutazioni osservate durante a vigilazione di virus.
L'anticorpi sò sviluppati per trattà u sindromu respiratoriu agutu severu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (1).L'anticorpi contr'à certi altri virus ponu esse resi inefficaci da mutazioni di virus selezziunate durante u trattamentu di i malati infettati (2, 3) o mutazioni virali chì si sò diffusi in u mondu per cunferisce resistenza à tuttu u clade di virus.Dunque, a determinazione di quali mutazioni SARS-CoV-2 ponu scappà di l'anticorpi chjave hè critica per valutà cumu e mutazioni osservate durante a surviglianza di virus affettanu l'efficacità di a terapia di anticorpi.
A maiò parte di l'anticorpi anti-SARS-CoV-2 dirigenu u duminiu di u ligame di u receptore virale (RBD), chì mediate u ligame à u receptore di l'enzima di cunversione di l'angiotensina 2 (ACE2) (5, 6).Ricertamenti, avemu sviluppatu un metudu di scansione di mutazione prufonda per cartografia cumu tutte e mutazioni di RBD affettanu a so funzione è u ricunniscenza da l'anticorpi antivirali (7, 8).U metudu implica a creazione di una biblioteca di mutanti RBD, esprimenduli nantu à a superficia di u levitu, è utilizendu a classificazione di e cellule attivate da fluorescenza è a sequenza profonda per quantificà cumu ogni mutazione affetta u plegamentu di RBD, l'affinità ACE2 (misurata in una serie di titration) è l'anticorpi. (Figura S1A).In questu studiu, avemu utilizatu a libreria mutante ripetitiva descritta in (7), chì hè cumposta di varianti RBD di codice à barre, chì copre 3804 di e 3819 mutazioni aminoacidi pussibuli.A nostra biblioteca hè stata preparata da u fondu geneticu RBD di u primu isolatu Wuhan-Hu-1.Ancu s'è a freccia di parechji mutanti hè in crescita, rapprisentanu sempre e sequenze RBD più cumuni (9, 10).Avemu disegnatu dui di 2034 mutazioni chì ùn disturbanu micca fermamente u plegamentu RBD è l'associazione ACE (7) cumu passà u cocktail REGN-COV2 (REGN10933 è REGN10987) (11, 12) è LY-CoV016 di Eli Lilly A forma recombinante di u l'anticorpu affetta u metudu di l'anticorpu di ubligatoriu (chjamatu ancu CB6 o JS016) (13) (Figura S1B).REGN-COV2 hè stata recentemente accordata un'autorizazione d'usu d'urgenza per COVID-19 (14), mentre chì LY-CoV016 hè attualmente in fase di prucessi clinichi di fase 3 (15).
[Glu406→Trp(E406W)] hà scappatu assai di a mistura di dui anticorpi (Figura 1A).A mappa di scappata di LY-CoV016 hà ancu revelatu parechje mutazioni di fuga in siti diversi in RBD (Figura 1B).Ancu s'è alcune mutazioni di escape ponu impedisce l'abilità di RBD di ligà à ACE2 o di spressione in una forma appiccicata apprupriata, secondu e misurazioni precedenti di scansione di mutazione profonda utilizendu RBD di levadura, assai mutazioni funzionali anu pocu o nimu effettu nantu à queste proprietà funzionali (7). ) (Figura 1, A è B rapprisentanu a perdita di l'affinità ACE2, mentri a Figura S2 rapprisenta a diminuzione di l'espressione RBD.
(A) Mappatura di l'anticorpu in REGN-COV2.U graficu di linea à a manca mostra a fuga in ogni situ in u RBD (a summa di tutte e mutazioni in ogni situ).L'imaghjini di u logu à a diritta mostra u locu di fuga forte (sottolinea viola).L'altezza di ogni lettera hè proporzionale à a forza di a fuga mediata da a mutazione di l'aminoacidu, è un "puntu di fuga" di 1 per ogni mutazione currisponde à una fuga cumpleta.A scala di l'axis y hè diversu per ogni fila, cusì, per esempiu, E406W scappa tutti l'anticorpi REGN, ma hè più ovvi per cocktails perchè hè sopraffattu da l'altri siti di scappu di l'anticorpi individuali.Per a versione scalabile, S2, A è B, sò usati per culurite a mappa da cumu e mutazioni affettanu l'espressione di RBD plegatu.S2, C è D sò usati per distribuisce l'influenza nantu à l'affinità ACE2 è l'espressione RBD trà tutte e mutazioni osservate in isolati di virus circulanti.(B) Cum'è mostra in (A), tira LY-CoV016.(C) Aduprate particelle lentivirali pseudotipate di spike per verificà e mutazioni chjave in u test di neutralizazione.Avemu sceltu di verificà e mutazioni chì sò previsti per avè un impattu più grande o esistenu à una freccia alta in isolati SARS-CoV-2 (cum'è N439K) in a circulazione.Ogni puntu rapprisenta l'aumentu di volte di a cuncentrazione inhibitoria mediana (IC50) di a mutazione relative à u piccu di u tipu salvaticu senza mutazione (WT) chì cuntene D614G.A linea tratteggiata blu 1 rapprisenta un effettu di neutralizazione simili à WT, è un valore> 1 rapprisenta una resistenza di neutralizazione aumentata.U culore di u puntu indica se vulete scappà da a mappa.I punti indicanu chì, postu chì l'IC50 hè fora di a serie di diluzione utilizata, u cambiamentu multiplu hè verificatu (limite superiore o inferiore).A maiò parte di i mutanti sò pruvati in duplicate, cusì ci sò dui punti.A curva di neutralizazione cumpleta hè mostrata in Figura 2. S3.L'abbreviazioni di una lettera di i residui d'aminoacidi sò i seguenti: A, Ala;C, cisteina;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, u so;I, Ile;K, lisina;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptofanu;è Y, Tyr.
Per verificà l'effettu antigenicu di e mutazioni chjave, avemu realizatu un esame di neutralizazione utilizendu particelle lentivirali pseudotipate di panicule, è truvamu chì ci era una coerenza trà a mappa di fuga di l'anticorpu è l'assay di neutralizazione (Figura 1C è Figura S3).Cum'è aspittatu da a mappa di l'anticorpi REGN-COV2, a mutazione in a pusizione 486 hè neutralizzata solu da REGN10933, mentre chì a mutazione in e pusizioni 439 è 444 hè neutralizzata solu da REGN10987, cusì queste mutazioni ùn ponu scappà.Ma E406W hà scappatu i dui anticorpi REGN-COV2, cusì hà scappatu ancu a mistura forte.Attraversu l'analisi strutturale è a selezzione di fuga di virus, Regeneron crede chì nisuna mutazione di l'aminoacidu ùn pò scappà di i dui anticorpi in u cocktail (11, 12), ma a nostra mappa completa identifica E406W cum'è una mutazione di fuga di cocktail.E406W affetta l'anticorpu REGN-COV2 in un modu relativamente specificu, è ùn interferiscenu micca seriamente cù a funzione di RBD, perchè riduce solu ligeramente l'effettu di neutralizazione di LY-CoV016 (Figura 1C) è u titulu di particelle lentivirali pseudotipate spiked (Figura 1C). S3F).
Per scopre se a nostra mappa di escape hè coherente cù l'evoluzione di virus sottu a selezzione di l'anticorpi, avemu prima verificatu i dati di l'esperimentu di selezzione di scappata di virus Regeneron, in quale u spike d'espressione hè statu cultivatu in cultura cellulare in presenza di qualsiasi REGN10933 U vesicular. virus stomatite (VSV), REGN10987 o cocktail REGN-COV2 (12).Stu travagliu hà identificatu cinque mutazioni di fuga da REGN10933, duie mutazioni di fuga da REGN10987, è nisuna mutazione da cocktail (Figura 2A).E mutazioni selezziunate da tutte e sette culturi di cellule sò messe in risaltu in a nostra mappa di fuga, è u cambiamentu nucleotide unicu di u codon salvaticu in a sequenza RBD Wuhan-Hu-1 hè ancu accessibile (Figura 2B), chì indica a diffarenza trà escapes Concordance. Graficu è evoluzione di virus sottu pressione di l'anticorpi in a cultura cellulare.Hè da nutà chì E406W ùn pò micca accede à i cambiamenti nucleotidi unichi, chì ponu spiegà perchè a selezzione di cocktail Regeneron ùn pò micca identificà malgradu a tolleranza relativamente bona di RBD plegamentu è affinità ACE2.
(A) In presenza di anticorpi, Regeneron usa u pseudotipu di panicule VSV per selezziunà e mutazioni di fuga di virus in a cultura cellulare (12).(B) U diagramma di escape, cum'è mostra in a Figura 1A, ma mostra solu e mutazioni accessibili da un solu cambiamentu di nucleotide in a sequenza Wuhan-Hu-1.Non-grigiu indica mutazioni in a cultura cellulare (rossu), è i pazienti infettati (blu) ), o i dui (viola).A Figura S5 mostra questi grafici, chì sò culurati da cumu e mutazioni affettanu l'affinità ACE2 o l'espressione RBD.(C) Cinetica di a mutazione RBD in i pazienti trattati cù REGN-COV2 in u 145esimu ghjornu di l'infezzione (linea verticale punteggiata nera).A freccia di ligame trà E484A è F486I hà aumentatu, ma postu chì E484A ùn hè micca una mutazione di fuga in a nostra figura, ùn hè micca mostratu in altri pannelli.Vede ancu figura.S4.(D) E mutazioni di scappata chì si trovanu in a cultura cellulare è i pazienti infettati sò accessibili da un unicu nucleotide, è u ligame di l'anticorpi di scappata ùn causa micca costu maiò à l'affinità ACE2 [cum'è misurata da u metudu di mostra di levitu (7)].Ogni puntu hè una mutazione, è a so forma è u culore indicanu s'ellu si pò accede è selezziunate durante a crescita di virus.I punti più dritti nantu à l'assi x indicanu una fuga di ubligatoriu di l'anticorpu più forte;i punti più alti nantu à l'assi y indicanu una affinità ACE2 più alta.
Per determinà se Escape Atlas pò analizà l'evoluzione di i virus chì infettanu l'omu, avemu esaminatu i dati di sequenza profonda da un paziente immunocompromisatu infettatu persistente chì hà ricevutu REGN-COV2 u 145esimu ghjornu dopu u diagnosticu di Trattamentu COVID-19 (16).U trattamentu tardu permette à a pupulazione virali di u paci per accumulà a diversità genetica, alcune di quale pò esse guidata da u stress immune, perchè u paci hà una risposta di anticorpi autoneutralizing debule prima di trattamentu (16).Dopu l'amministrazione di REGN-COV2, a frequenza di cinque mutazioni aminoacidi in RBD hà cambiatu rapidamente (Figura 2C è Figura S4).A nostra mappa di fuga hà dimustratu chì trè di queste mutazioni scappavanu REGN10933 è una scappò REGN10987 (Figura 2B).Hè nutate chì dopu à u trattamentu di l'anticorpu, micca tutte e mutazioni sò stati trasferiti à u situ fissu.À u cuntrariu, ci hè a crescita è a caduta di a cumpetizione (Figura 2C).Stu mudellu hè statu osservatu in l'evoluzione interna di l'ospiti adattativi di l'altri virus (17, 18), possibbilmente per via di a cumpetizione trà i lignaghji genetichi free-riding è virali.E duie forze parenu ghjucà un rolu in i malati cù infezzione persistente (Figura 2C è Figura S4C): E484A (micca una mutazione di scappata in u nostru diagrama) è F486I (scappa REGN10933) free-riding dopu à trattamentu, è lignaggi di virus chì portanu N440D È Q493K (scapendu REGN10987 è REGN10933, rispettivamente) hà prima cumpetitu cù REGN10933 escape mutant Y489H, è dopu hà cuncorsu cù u lignamentu chì portava E484A è F486I è Q493K.
Trè di e quattru mutazioni di fuga in i pazienti trattati cù REGN-COV2 ùn sò micca identificate in a selezzione di a cultura di u virus di Regeneron (Figura 2B), chì illustra u vantaghju di a mappa cumpleta.A selezzione di virus hè incompleta perchè ponu identificà solu qualsiasi mutazioni selezziunate aleatoriamente in quellu esperimentu particulare di cultura cellulare.À u cuntrariu, a mappa cumpleta annotate tutte e mutazioni, chì ponu include mutazioni causate da ragioni chì ùn sò micca ligati à u trattamentu, ma affettanu accidentalmente l'anticorpi.
Di sicuru, l'evoluzione di virus hè affettata da limitazioni funziunali è pressione per evade l'anticorpi.E mutazioni è i pazienti selezziunati in a cultura cellulare sempre rispondenu à i seguenti criterii: scappanu da l'anticorpi, ponu entre per un unicu cambiamentu di nucleotide, è anu pocu o nuddu costu per l'affinità ACE2 [per mezu di e mutazioni prufonde precedenti mostrate cù a misurazione di scanning RBD (7). )] (Figura 2D è Figura S5).Dunque, una mappa cumpleta di cumu e mutazioni affettanu i fenotipi biochimici chjave di RBD (cum'è l'ACE è l'anticorpi) pò esse aduprata per valutà i percorsi pussibuli per l'evoluzione di virus.Una caveat hè chì in un marcu di u tempu evolutivu più longu, cum'è osservatu in l'immunità virali è a fuga di droga, per via di interazzione epistatica, u spaziu di toleranza per mutazioni pò cambià (19-21).
A mappa cumpleta ci permette di valutà e mutazioni di fuga esistenti in u SARS-CoV-2 circulante.Avemu verificatu tutte e sequenze SARS-CoV-2 derivate da l'omu dispunibule da l'11 di ghjennaghju di u 2021 è truvamu chì un gran numaru di mutazioni RBD scappavanu unu o più anticorpi (Figura 3).In ogni casu, l'unica mutazione di escape presente in> 0.1% di a sequenza hè REGN10933 escape mutant Y453F [0.3% di a sequenza;vede (12)], REGN10987 escape mutant N439K [1.7% di a sequenza;vede Figura 1C è (22)], E LY-CoV016 scappa mutazione K417N (sequenza 0.1%; vede ancu Figura 1C).Y453F hè assuciatu cù focu indipendenti ligati à l'agricultori di visoni in l'Olanda è in Danimarca (23, 24);vale a pena nutà chì a sequenza di visone stessu cuntene qualchì volta altre mutazioni di fuga, cum'è F486L (24).N439K hè assai populari in Auropa, è custituisce una gran parte di a sequenza da a Scozia è l'Irlanda in Europa (22, 25).K417N esiste in a linea B.1.351 scuperta prima in Sudafrica (10).Una altra mutazione di preoccupazione attuale hè N501Y, chì hè presente in B.1.351 è ancu in u lignamentu B.1.1.7 urigginariu identificatu in u Regnu Unitu (9).A nostra mappa mostra chì N501Y ùn hà micca effettu nantu à l'anticorpu REGN-COV2, ma solu effettu moderatu nantu à LY-CoV016 (Figura 3).
Per ogni anticorpu o combinazione di anticorpi, da l'11 di ghjennaghju di u 2021, trà e 317,866 sequenze SARS-CoV-2 di alta qualità derivate da l'omu nantu à GISAID (26), a relazione trà u puntu di scappata per ogni mutazione è a so frequenza.Hè marcatu.A mutazione di fuga di cocktail REGN-COV2 E406W richiede cambiamenti di nucleotidi multipli in a sequenza Wuhan-Hu-1 RBD, è ùn hè micca osservata in a sequenza GISAID.Altre mutazioni di u residuu E406 (E406Q è E406D) sò state osservate cù cunti di freccia bassa, ma questi aminoacidi mutanti ùn sò micca mutazioni di nucleotidi unichi luntanu da W.
Comu s'aspittava, i mutazioni di scappata sò generalmente in l'interfaccia di anticorpi-RBD.Tuttavia, a struttura sola ùn hè micca abbastanza per predice chì mutazioni mediate a fuga.Per esempiu, LY-CoV016 usa e so catene pesanti è ligeri per ligà à un epitope largu chì si sovrappone à a superficia di ubligatoriu ACE2, ma u prucessu di scappata implica mutazioni in i residui RBD in a regione di determinazione di a complementarità di a catena pesante (Figura 4A è Figura S6, E à G).In cuntrastu, fughje da REGN10933 è REGN10987 principarmenti accadutu à i residui RBD impilati à l'interfaccia di catene pesanti è leggere di anticorpi (Figura 4A è Figura S6, A à D).A mutazione E406W chì hà scappatu di a mistura REGN-COV2 hè accaduta à i residui chì ùn eranu micca in cuntattu cù l'anticorpi (Figura 4, A è B).Ancu se E406 hè strutturalmente più vicinu à LY-CoV016 (Figura 4B è Figura S6H), a mutazione E406W hà un effettu assai più chjucu nantu à l'anticorpu (Figura 1, B è C), chì indica chì u mecanismu strutturale specificu à longu andà hè anti-REGN. - Anticorpu COV2 (Figura S6I).In riassuntu, e mutazioni in i residui RBD in cuntattu cù l'anticorpi ùn sò micca sempre mediate a fuga, è alcune mutazioni di fuga significativu si trovanu à i residui chì ùn sò micca in cuntattu cù l'anticorpi (Figura 4B è Figura S6, D è G).
(A) U diagramma di fuga prughjettatu nantu à a struttura RBD ligata da l'anticorpu.[REGN10933 è REGN10987: Protein Database (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].I duminii variabili di e catene pisanti è ligeri di l'anticorpu sò mostrati cum'è cartoni blu, è u culore nantu à a superficia di u RBD indica a forza di a fuga mediata da a mutazione in questu situ (u biancu indica micca scappata, è u rossu indica u più forte). locu di scappu di l'anticorpu o mistura).I siti chì ùn sò micca funziunali mutati sò grisgiu.(B) Per ogni anticorpu, classificà u situ cum'è cuntattu direttu di l'anticorpu (atomi non-idrogenu in 4Å di l'anticorpu), anticorpu prossimale (4 à 8Å) o anticorpu distale (> 8Å).Ogni puntu rapprisenta un situ, divisu in escape (rossu) o non escape (nìuru).A linea tratteggiata grisa rapprisenta u valore criticu utilizatu per classificà u situ cum'è escape o non-escape (per i dettagli, vede Materiali è Metodi).I numeri rossi è neri indicanu quanti siti in ogni categuria sò scappati o unscaped.
In questu studiu, avemu mappatu cumplettamente e mutazioni chì evade i trè anticorpi anti-SARS-CoV-2 maiò.Queste carte indicanu chì a caracterizazione previa di e mutazioni di fuga hè incompleta.Nè mutazioni uniche di aminoacidi chì ponu scappà i dui anticorpi in u cocktail REGN-COV2 ùn sò state identificate, nè identificanu a maiò parte di i pazienti infettivi persistenti trattati cù u cocktail.mutazione.Di sicuru, a nostra mappa ùn hà ancu rispostu à a quistione più pressante: SARS-CoV-2 svilupperà una resistenza estensiva à questi anticorpi?Ma ciò chì hè sicuru hè chì hè preoccupatu chì tante mutazioni di scappata anu pocu effettu nantu à u plegamentu RBD o l'affinità di u receptore, è ci sò digià alcune mutazioni di pocu livellu in i virus circulanti.À a fine, hè necessariu aspittà è osservà quali mutazioni SARS-CoV-2 trasmettenu quandu si sparghje trà a pupulazione.U nostru travagliu aiuterà à "osservazione" spieghendu immediatamente l'impattu di e mutazioni classificate da a vigilazione di u genoma virali.
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Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
A mappa cumpleta di e mutazioni SARS-CoV-2 chì scappanu da a mistura di anticorpi monoclonali Regeneron aiuta à spiegà l'evoluzione di u virus in u trattamentu di i pazienti.
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Tempu di Postu: Feb-24-2021