Několik protilátek se již používá nebo je ve vývoji jako terapie pro léčbu COVID-19.Se vznikem nových variant koronaviru 2 těžkého akutního respiračního syndromu (SARS-CoV-2) je důležité předpovědět, zda budou stále citlivé na protilátkovou terapii.Starr a kol.Byla použita knihovna kvasinek, která pokrývá všechny mutace ve vazebné doméně receptoru SARS-CoV-2, které nebudou silně narušovat vazbu na hostitelský receptor (ACE2), a mapuje, jak tyto mutace ovlivňují tři hlavní anti-SARS-CoV -2 vazba protilátky.Tyto obrázky identifikují mutace, které unikají vazbě protilátky, včetně jednotlivých mutací, které unikají dvěma protilátkám ve směsi protilátek Regeneron.U lidí se šíří mnoho mutací, které unikají jediné protilátce.
Protilátky jsou potenciální terapií pro léčbu těžkého akutního respiračního syndromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2), ale není jasné, že se virus vyvíjí, aby unikl jejich riziku.Zde mapujeme, jak všechny mutace ve vazebné doméně SARS-CoV-2 receptoru (RBD) ovlivňují vazbu REGN-COV2 koktejlu na protilátku LY-CoV016.Tyto kompletní mapy odhalily mutaci aminokyselin, která se zcela vyhnula směsi REGN-COV2, která se skládá ze dvou protilátek REGN10933 a REGN10987, které cílí na různé strukturální epitopy.Tyto obrázky také identifikují mutace viru vybrané u trvale infikovaných pacientů léčených REGN-COV2 a během in vitro selekce úniku viru.A konečně, tato čísla ukazují, že mutace, které unikají jediné protilátce, jsou již přítomny v cirkulujících kmenech SARS-CoV-2.Tyto úplné únikové mapy mohou vysvětlit důsledky mutací pozorovaných během sledování virů.
Vyvíjejí se protilátky k léčbě těžkého akutního respiračního syndromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (1).Protilátky proti některým dalším virům mohou být neúčinné virovými mutacemi vybranými během léčby infikovaných pacientů (2, 3) nebo virovými mutacemi, které se rozšířily globálně, aby propůjčily rezistenci celému virovému kladu.Určení, které mutace SARS-CoV-2 mohou uniknout klíčovým protilátkám, je proto zásadní pro posouzení toho, jak mutace pozorované během virového dozoru ovlivňují účinnost protilátkové terapie.
Většina předních protilátek proti SARS-CoV-2 se zaměřuje na virovou receptorovou vazebnou doménu (RBD), která zprostředkovává vazbu na receptor angiotenzin konvertujícího enzymu 2 (ACE2) (5, 6).Nedávno jsme vyvinuli metodu skenování hlubokých mutací, abychom zmapovali, jak všechny mutace RBD ovlivňují její funkci a rozpoznávání antivirovými protilátkami (7, 8).Metoda zahrnuje vytvoření knihovny mutantů RBD, jejich expresi na povrchu kvasinek a použití fluorescenčně aktivovaného třídění buněk a hlubokého sekvenování ke kvantifikaci toho, jak každá mutace ovlivňuje skládání RBD, afinitu ACE2 (měřenou v titrační sérii) a vazbu protilátek. (Obrázek S1A).V této studii jsme použili knihovnu repetitivních mutantů popsanou v (7), která se skládá z variant RBD s čárovým kódem, které pokrývají 3804 z 3819 možných mutací aminokyselin.Naše knihovna byla připravena z genetického pozadí RBD raného izolátu Wuhan-Hu-1.Přestože se frekvence několika mutantů zvyšuje, stále představují nejběžnější sekvence RBD (9, 10).Nakreslili jsme dvě z 2034 mutací, které silně nenarušují skládání RBD a vazbu ACE (7), jak předat koktejl REGN-COV2 (REGN10933 a REGN10987) (11, 12) a LY-CoV016 Eli Lilly Rekombinantní forma Protilátka ovlivňuje způsob vazby protilátky (také nazývaný CB6 nebo JS016) (13) (obrázek S1B).REGN-COV2 bylo nedávno uděleno povolení k nouzovému použití pro COVID-19 (14), zatímco LY-CoV016 v současné době prochází 3. fází klinických studií (15).
[Glu406→Trp(E406W)] silně unikal směsi dvou protilátek (obrázek 1A).Úniková mapa LY-CoV016 také odhalila mnoho únikových mutací na různých místech v RBD (obrázek 1B).Ačkoli některé únikové mutace mohou zhoršit schopnost RBD vázat se na ACE2 nebo exprimovat ve vhodně složené formě, podle předchozích měření skenování hlubokých mutací pomocí RBD vystavených kvasinkami má mnoho funkčních mutací malý nebo žádný vliv na tyto funkční vlastnosti (7 ) (Obrázek 1, A a B představují ztrátu afinity ACE2, zatímco obrázek S2 představuje snížení exprese RBD.
(A) Mapování protilátky v REGN-COV2.Spojnicový graf vlevo ukazuje únik na každém místě v RBD (součet všech mutací na každém místě).Obrázek loga vpravo ukazuje silné únikové místo (fialové podtržení).Výška každého písmene je úměrná síle úniku zprostředkovaného mutací aminokyseliny a „únikové skóre“ 1 pro každou mutaci odpovídá úplnému úniku.Stupnice na ose y je pro každý řádek jiná, takže např. E406W uniká všem REGN protilátkám, ale nejvíce je to patrné u koktejlů, protože je zahlceno ostatními únikovými místy jednotlivých protilátek.U škálovatelné verze se S2, A a B používají k vybarvení mapy podle toho, jak mutace ovlivňují expresi složeného RBD.S2, C a D se používají k rozdělení vlivu na afinitu ACE2 a expresi RBD mezi všechny mutace pozorované u izolátů cirkulujícího viru.(B) Jak je znázorněno na (A), nakreslete LY-CoV016.(C) Použijte spike-pseudotypizované lentivirové částice k ověření klíčových mutací v neutralizačním testu.Rozhodli jsme se ověřit mutace, u kterých se předpokládá, že budou mít větší dopad nebo se vyskytují s vysokou frekvencí u izolátů SARS-CoV-2 (jako je N439K) v oběhu.Každý bod představuje násobek zvýšení střední inhibiční koncentrace (IC50) mutace vzhledem k vrcholu nemutovaného divokého typu (WT) obsahujícího D614G.Modrá přerušovaná čára 1 představuje neutralizační účinek podobný WT a hodnota > 1 představuje zvýšený neutralizační odpor.Barva tečky označuje, zda chcete z mapy uniknout.Tečky označují, že protože IC50 je mimo použitou sérii ředění, je zkontrolována vícenásobná změna (horní nebo spodní limit).Většina mutantů je testována duplicitně, takže existují dva body.Kompletní neutralizační křivka je znázorněna na obrázku 2. S3.Jednopísmenné zkratky aminokyselinových zbytků jsou následující: A, Ala;C, cystein;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, jeho;I, Ile;K, lysin;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gin;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, tryptofan;a Y, Tyr.
Abychom ověřili antigenní účinek klíčových mutací, provedli jsme neutralizační test s použitím lentivirových částic pseudotypizovaných panicle a zjistili jsme, že existuje konzistence mezi únikovou mapou vazby protilátky a neutralizačním testem (obrázek 1C a obrázek S3).Jak se očekává z mapy protilátky REGN-COV2, mutace v poloze 486 je neutralizována pouze REGN10933, zatímco mutace v pozicích 439 a 444 je neutralizována pouze REGN10987, takže tyto mutace nemohou uniknout.Ale E406W unikla dvěma protilátkám REGN-COV2, takže také silně unikla směsi.Prostřednictvím strukturální analýzy a selekce úniku viru Regeneron věří, že žádná mutace jedné aminokyseliny nemůže uniknout dvěma protilátkám v koktejlu (11, 12), ale naše kompletní mapa identifikuje E406W jako mutaci úniku koktejlu.E406W ovlivňuje protilátku REGN-COV2 relativně specifickým způsobem a vážně neinterferuje s funkcí RBD, protože jen mírně snižuje neutralizační účinek LY-CoV016 (obrázek 1C) a titr špičatých pseudotypových lentivirových částic ( obrázek S3F).
Abychom prozkoumali, zda je naše úniková mapa konzistentní s evolucí virů pod selekcí protilátek, nejprve jsme zkontrolovali data experimentu Regeneron virus escape selection experiment, ve kterém byl expresní hrot pěstován v buněčné kultuře v přítomnosti jakéhokoli REGN10933 The vezicular virus stomatitidy (VSV), REGN10987 nebo koktejl REGN-COV2 (12).Tato práce identifikovala pět únikových mutací z REGN10933, dvě únikové mutace z REGN10987 a žádné mutace z koktejlu (obrázek 2A).Mutace vybrané všemi sedmi buněčnými kulturami jsou zvýrazněny v naší únikové mapě a dostupná je také jednonukleotidová změna kodonu divokého typu v sekvenci Wuhan-Hu-1 RBD (obrázek 2B), což ukazuje na rozdíl mezi úniky konkordance graf a vývoj viru pod tlakem protilátky v buněčné kultuře.Stojí za zmínku, že E406W nemůže být přístupný změnami jednoho nukleotidu, což může vysvětlovat, proč ho výběr koktejlu Regeneron nemůže identifikovat navzdory relativně dobré toleranci skládání RBD a afinitě ACE2.
(A) V přítomnosti protilátek používá Regeneron panicle pseudotyp VSV k výběru mutací unikajících viru v buněčné kultuře (12).(B) Schéma úniku, jak je znázorněno na obrázku 1A, ale ukazuje pouze mutace dostupné změnou jediného nukleotidu v sekvenci Wuhan-Hu-1.Nešedá barva označuje mutace v buněčné kultuře (červená) a infikované pacienty (modrá) nebo obojí (fialová).Obrázek S5 ukazuje tyto grafy, které jsou zbarveny podle toho, jak mutace ovlivňují afinitu ACE2 nebo expresi RBD.(C) Kinetika mutace RBD u pacientů léčených REGN-COV2 145. den infekce (černá tečkovaná svislá čára).Frekvence vazby mezi E484A a F486I se zvýšila, ale protože E484A není únikovou mutací na našem obrázku, není zobrazena na jiných panelech.Viz také obrázek.S4.(D) Únikové mutace, které se vyskytují v buněčné kultuře a infikovaných pacientech, jsou dostupné jediným nukleotidem a vazba únikových protilátek nezpůsobuje žádné velké náklady na afinitu ACE2 [jak bylo měřeno metodou kvasinkového displeje (7)].Každý bod je mutací a jeho tvar a barva naznačují, zda k němu lze přistupovat a vybrat jej během růstu viru.Čím více bodů vpravo na ose x indikuje silnější únik vazby protilátky;vyšší body na ose y indikují vyšší afinitu ACE2.
Abychom zjistili, zda Escape Atlas dokáže analyzovat vývoj virů infikujících lidi, prozkoumali jsme data hlubokého sekvenování od trvale infikovaného pacienta s oslabenou imunitou, který dostal REGN-COV2 145. den po diagnóze léčby COVID-19 (16).Pozdní léčba umožňuje virové populaci pacienta akumulovat genetickou rozmanitost, z nichž některé mohou být řízeny imunitním stresem, protože pacient má před léčbou slabou autoneutralizační protilátkovou odpověď (16).Po podání REGN-COV2 se frekvence pěti aminokyselinových mutací v RBD rychle změnila (obrázek 2C a obrázek S4).Naše úniková mapa ukázala, že tři z těchto mutací unikly REGN10933 a jedna unikla REGN10987 (obrázek 2B).Stojí za zmínku, že po léčbě protilátkou nebyly všechny mutace přeneseny do fixního místa.Naopak dochází k nárůstu a poklesu konkurence (obrázek 2C).Tento vzorec byl pozorován ve vnitřní evoluci adaptivních hostitelů jiných virů (17, 18), pravděpodobně kvůli konkurenci mezi genetickými parazity a virovými liniemi.Zdá se, že obě tyto síly hrají roli u pacientů s přetrvávající infekcí (obrázek 2C a obrázek S4C): E484A (nejedná se o únikovou mutaci v našem diagramu) a F486I (únik REGN10933) parazitující po léčbě a virové linie nesoucí N440D a Q493K (unikající REGN10987 a REGN10933, v tomto pořadí) nejprve soutěžil s únikovou mutantou REGN10933 Y489H a poté soutěžil s linií nesoucí E484A a F486I a Q493K.
Tři ze čtyř únikových mutací u pacientů léčených REGN-COV2 nebyly identifikovány při selekci buněčné kultury viru Regeneron (obrázek 2B), což ilustruje výhodu úplné mapy.Výběr virů je neúplný, protože mohou identifikovat pouze mutace náhodně vybrané v tomto konkrétním experimentu s buněčnou kulturou.Naopak, kompletní mapa anotuje všechny mutace, které mohou zahrnovat mutace způsobené důvody nesouvisejícími s léčbou, ale náhodně ovlivňují vazbu protilátky.
Evoluci virů samozřejmě ovlivňují funkční omezení a tlak na únik protilátek.Mutace a pacienti vybraní v buněčné kultuře vždy splňují následující kritéria: unikají vazbě protilátky, mohou vstoupit prostřednictvím jediné změny nukleotidu a mají malé nebo žádné náklady na afinitu ACE2 [díky předchozím hlubokým mutacím zobrazeným pomocí měření RBD skenováním kvasinek (7 )] (obrázek 2D a obrázek S5).Úplná mapa toho, jak mutace ovlivňují klíčové biochemické fenotypy RBD (jako je ACE a vazba protilátek), tedy může být použita k posouzení možných cest pro evoluci viru.Jednou výhradou je, že v delším evolučním časovém rámci, jak bylo pozorováno u virové imunity a úniku léku, se v důsledku epistatických interakcí může změnit toleranční prostor pro mutace (19-21).
Kompletní mapa nám umožňuje vyhodnotit existující únikové mutace v cirkulujícím SARS-CoV-2.Zkontrolovali jsme všechny dostupné sekvence SARS-CoV-2 pocházející z člověka k 11. lednu 2021 a zjistili jsme, že velké množství mutací RBD uniklo jedné nebo více protilátkám (obrázek 3).Avšak jediná úniková mutace přítomná v >0,1 % sekvence je REGN10933 úniková mutace Y453F [0,3 % sekvence;viz (12)], REGN10987 úniková mutanta N439K [1,7 % sekvence;viz obrázek 1C a (22)] a LY-CoV016 úniková mutace K417N (0,1% sekvence; viz také obrázek 1C).Y453F je spojena s nezávislými ohnisky souvisejícími s norkovými farmami v Nizozemsku a Dánsku (23, 24);stojí za zmínku, že samotná norková sekvence někdy obsahuje další únikové mutace, jako je F486L (24).N439K je v Evropě velmi populární a tvoří velkou část sekvence ze Skotska a Irska v Evropě (22, 25).K417N existuje v linii B.1.351 poprvé objevené v Jižní Africe (10).Další mutací v současné době je N501Y, která je přítomna v B.1.351 a také v B.1.1.7 linii původně identifikované ve Spojeném království (9).Naše mapa ukazuje, že N501Y nemá žádný účinek na protilátku REGN-COV2, ale pouze mírný účinek na LY-CoV016 (obrázek 3).
Pro každou protilátku nebo kombinaci protilátek, k 11. lednu 2021, mezi 317 866 vysoce kvalitními lidskými sekvencemi SARS-CoV-2 na GISAID (26), vztah mezi únikovým skóre pro každou mutaci a její frekvencí.Je označeno.E406W koktejlová úniková mutace REGN-COV2 vyžaduje vícenásobné nukleotidové změny v sekvenci Wuhan-Hu-1 RBD a není pozorována v sekvenci GISAID.Jiné mutace zbytku E406 (E406Q a E406D) byly pozorovány s nízkou frekvencí, ale tyto mutantní aminokyseliny nejsou jednonukleotidové mutace daleko od W.
Jak se očekávalo, únikové mutace se obvykle vyskytují na rozhraní protilátka-RBD.Samotná struktura však nestačí k předpovědi, které mutace zprostředkovávají únik.Například LY-CoV016 využívá své těžké a lehké řetězce k navázání na široký epitop, který překrývá vazebný povrch ACE2, ale proces úniku zahrnuje mutace ve zbytcích RBD v oblasti určující komplementaritu těžkého řetězce (obrázek 4A a obrázek S6, E až G).Na rozdíl od toho k únikům z REGN10933 a REGN10987 docházelo hlavně u zbytků RBD naskládaných na rozhraní těžkých a lehkých řetězců protilátky (obrázek 4A a obrázek S6, A až D).Mutace E406W, která unikla ze směsi REGN-COV2, se vyskytla na zbytcích, které nebyly v kontaktu s žádnou protilátkou (obrázek 4, A a B).Ačkoli je E406 strukturálně blíže k LY-CoV016 (obrázek 4B a obrázek S6H), mutace E406W má mnohem menší účinek na protilátku (obrázek 1, B a C), což naznačuje, že specifický strukturní mechanismus na dlouhé vzdálenosti je anti-REGN - protilátka COV2 (obrázek S6I).Stručně řečeno, mutace na zbytcích RBD v kontaktu s protilátkami ne vždy zprostředkovávají únik a některé významné únikové mutace se vyskytují na zbytcích, které nejsou v kontaktu s protilátkami (obrázek 4B a obrázek S6, D a G).
(A) Únikový diagram promítnutý na strukturu RBD vázanou protilátkou.[REGN10933 a REGN10987: Proteinová databáze (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].Variabilní domény těžkého a lehkého řetězce protilátky jsou zobrazeny jako modré kreslené obrázky a barva na povrchu RBD označuje sílu mutací zprostředkovaného úniku v tomto místě (bílá označuje žádný únik a červená označuje nejsilnější únikové místo protilátky nebo směsi).Stránky, které nejsou funkčně zmutované, jsou zašedlé.(B) Pro každou protilátku klasifikujte místo jako přímý kontakt protilátky (nevodíkové atomy do 4Á od protilátky), proximální protilátka (4 až 8Á) nebo distální protilátka (> 8Á).Každý bod představuje místo rozdělené na únikové (červené) nebo neúnikové (černé).Šedá přerušovaná čára představuje kritickou hodnotu použitou ke klasifikaci místa jako únikového nebo neúnikového (podrobnosti viz Materiály a metody).Červená a černá čísla označují, kolik webů v každé kategorii bylo uniknuto nebo neescapováno.
V této studii jsme kompletně zmapovali mutace, které se vyhýbají třem hlavním anti-SARS-CoV-2 protilátkám.Tyto mapy ukazují, že předchozí charakterizace únikových mutací je neúplná.Nebyly identifikovány ani mutace jedné aminokyseliny, které by mohly uniknout dvěma protilátkám v koktejlu REGN-COV2, ani neidentifikovali většinu pacientů s přetrvávající infekcí léčených koktejlem.mutace.Naše mapa samozřejmě ještě neodpověděla na nejnaléhavější otázku: Vyvine si SARS-CoV-2 rozsáhlou rezistenci vůči těmto protilátkám?Jisté však je, že je znepokojivé, že tolik únikových mutací má malý vliv na skládání RBD nebo afinitu k receptorům a že v cirkulujících virech již existují některé mutace na nízké úrovni.Nakonec je třeba počkat a pozorovat, jaké mutace SARS-CoV-2 přenese, až se rozšíří mezi populaci.Naše práce pomůže „pozorování“ okamžitým vysvětlením dopadu mutací klasifikovaných sledováním virového genomu.
Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution License.Článek umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu za podmínky, že původní dílo je řádně citováno.
Poznámka: Uveďte svou e-mailovou adresu pouze proto, aby osoba, kterou na stránku doporučujete, věděla, že chcete, aby e-mail viděla a že se nejedná o spam.Nebudeme zaznamenávat žádné e-mailové adresy.
Tato otázka se používá k testování, zda jste návštěvník, a k zamezení automatického odesílání spamu.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Kompletní mapa mutací SARS-CoV-2, které unikají směsi monoklonálních protilátek Regeneron, pomáhá vysvětlit vývoj viru při léčbě pacientů.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Kompletní mapa mutací SARS-CoV-2, které unikají směsi monoklonálních protilátek Regeneron, pomáhá vysvětlit vývoj viru při léčbě pacientů.
©2021 American Association for the Advancement of Science.všechna práva vyhrazena.AAAS je partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Čas odeslání: 24. února 2021