Adskillige antistoffer er allerede i brug eller under udvikling som terapier til behandling af COVID-19.Med fremkomsten af nye varianter af alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), er det vigtigt at forudsige, om de stadig vil være modtagelige for antistofbehandling.Starr et al.Der blev brugt et gærbibliotek, som dækker alle mutationer i SARS-CoV-2 receptorbindingsdomænet, som ikke vil forstyrre bindingen til værtsreceptoren (ACE2), og kortlægge, hvordan disse mutationer påvirker de tre hovedanti-SARS-CoV -2 antistofbinding.Disse figurer identificerer mutationer, der undslipper antistofbinding, herunder enkelte mutationer, der undslipper de to antistoffer i Regeneron-antistofblandingen.Mange mutationer, der undslipper et enkelt antistof, spredes i mennesker.
Antistoffer er en potentiel terapi til behandling af alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), men det er ikke klart, at virussen udvikler sig for at undslippe deres risiko.Her kortlægger vi, hvordan alle mutationer i SARS-CoV-2-receptorbindingsdomænet (RBD) påvirker bindingen af REGN-COV2-cocktailen til antistoffet LY-CoV016.Disse komplette kort afslørede en aminosyremutation, der fuldstændig undgik REGN-COV2-blandingen, som er sammensat af to antistoffer REGN10933 og REGN10987, der målretter mod forskellige strukturelle epitoper.Disse tal identificerer også virusmutationer udvalgt i vedvarende inficerede patienter behandlet med REGN-COV2 og under in vitro-virusudslip-selektion.Endelig afslører disse tal, at mutationer, der undslipper et enkelt antistof, allerede er til stede i cirkulerende SARS-CoV-2-stammer.Disse komplette flugtkort kan forklare konsekvenserne af mutationer observeret under virusovervågning.
Antistoffer udvikles til at behandle alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (1).Antistoffer mod visse andre vira kan gøres ineffektive af virusmutationer udvalgt under behandlingen af inficerede patienter (2, 3) eller virusmutationer, der har spredt sig globalt for at give resistens til hele viruskladen.Derfor er det afgørende at bestemme, hvilke SARS-CoV-2-mutationer, der kan undslippe nøgleantistoffer, for at vurdere, hvordan mutationer observeret under virusovervågning påvirker effektiviteten af antistofterapi.
De fleste førende anti-SARS-CoV-2-antistoffer retter sig mod det virale receptorbindingsdomæne (RBD), som medierer binding til den angiotensinkonverterende enzym 2 (ACE2)-receptor (5, 6).For nylig har vi udviklet en dyb mutationsscanningsmetode til at kortlægge, hvordan alle mutationer af RBD påvirker dets funktion og genkendelse af antivirale antistoffer (7, 8).Metoden involverer at skabe et bibliotek af RBD-mutanter, udtrykke dem på overfladen af gær og bruge fluorescensaktiveret cellesortering og dyb sekventering til at kvantificere, hvordan hver mutation påvirker RBD-foldning, ACE2-affinitet (målt i en titreringsserie) og antistofbinding. (Figur S1A).I denne undersøgelse brugte vi det gentagne mutantbibliotek beskrevet i (7), som er sammensat af stregkodede RBD-varianter, der dækker 3804 af de 3819 mulige aminosyremutationer.Vores bibliotek blev fremstillet ud fra RBD genetiske baggrund af det tidlige isolat Wuhan-Hu-1.Selvom frekvensen af flere mutanter er stigende, repræsenterer de stadig de mest almindelige RBD-sekvenser (9, 10).Vi har tegnet to af 2034 mutationer, der ikke stærkt forstyrrer RBD-foldning og ACE-binding (7), hvordan man passerer REGN-COV2-cocktailen (REGN10933 og REGN10987) (11, 12) og Eli Lillys LY-CoV016 Den rekombinante form af antistof påvirker metoden til at binde antistof (også kaldet CB6 eller JS016) (13) (Figur S1B).REGN-COV2 fik for nylig en nødbrugstilladelse til COVID-19 (14), mens LY-CoV016 i øjeblikket gennemgår fase 3 kliniske forsøg (15).
[Glu406→Trp(E406W)] undslap stærkt blandingen af to antistoffer (figur 1A).Flugtkortet for LY-CoV016 afslørede også mange flugtmutationer på forskellige steder i RBD (figur 1B).Selvom nogle escape-mutationer kan svække RBD's evne til at binde til ACE2 eller udtrykke sig i en passende foldet form, ifølge tidligere målinger af dyb mutationsscanning ved hjælp af gær-vist RBD, har mange funktionelle mutationer ringe eller ingen effekt på disse funktionelle egenskaber (7 ) (Figur 1, A og B repræsenterer tabet af ACE2-affinitet, mens figur S2 repræsenterer faldet i RBD-ekspression.
(A) Kortlægning af antistoffet i REGN-COV2.Linjegrafen til venstre viser flugten på hvert sted i RBD (summen af alle mutationer på hvert sted).Logobilledet til højre viser det stærke flugtsted (lilla understregning).Højden af hvert bogstav er proportional med styrken af escape medieret af aminosyremutationen, og en "escape score" på 1 for hver mutation svarer til en fuldstændig escape.Y-akseskalaen er forskellig for hver række, så f.eks. undgår E406W alle REGN-antistoffer, men den er mest oplagt for cocktails, fordi den overvældes af de andre flugtsteder for individuelle antistoffer.For den skalerbare version bruges S2, A og B til at farve kortet efter, hvordan mutationer påvirker udtrykket af foldet RBD.S2, C og D bruges til at fordele indflydelsen på ACE2-affinitet og RBD-ekspression blandt alle mutationer observeret i cirkulerende virusisolater.(B) Som vist i (A), tegn LY-CoV016.(C) Brug spike-pseudotypede lentivirale partikler til at verificere nøglemutationer i neutraliseringsassayet.Vi valgte at verificere de mutationer, der forventes at have en større indvirkning eller eksisterer ved en høj frekvens i SARS-CoV-2-isolater (såsom N439K) i cirkulationen.Hvert punkt repræsenterer foldstigningen af den mediane inhiberende koncentration (IC50) af mutationen i forhold til toppen af den umuterede vildtype (WT) indeholdende D614G.Den blå stiplede linje 1 repræsenterer en neutraliseringseffekt svarende til WT, og en værdi > 1 repræsenterer en øget neutraliseringsmodstand.Farven på prikken angiver, om du vil flygte fra kortet.Prikkerne indikerer, at da IC50 er uden for den anvendte fortyndingsserie, kontrolleres den multiple ændring (øvre eller nedre grænse).De fleste mutanter testes i to eksemplarer, så der er to punkter.Den komplette neutraliseringskurve er vist i figur 2. S3.Et-bogstavsforkortelserne af aminosyrerester er som følger: A, Ala;C, cystein;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, hans;I, Ile;K, lysin;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gin;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, tryptofan;og Y, Tyr.
For at verificere den antigene effekt af nøglemutationer udførte vi et neutraliseringsassay ved hjælp af panikel-pseudotypede lentivirale partikler og fandt ud af, at der var en overensstemmelse mellem det antistofbindende flugtkort og neutraliseringsassayet (figur 1C og figur S3).Som forventet fra REGN-COV2-antistofkortet neutraliseres mutationen i position 486 kun af REGN10933, mens mutationen ved position 439 og 444 kun neutraliseres af REGN10987, så disse mutationer kan ikke undslippe.Men E406W undslap de to REGN-COV2 antistoffer, så den slap også stærkt fra blandingen.Gennem strukturel analyse og selektion af virusudslip mener Regeneron, at ingen enkelt aminosyremutation kan undslippe de to antistoffer i cocktailen (11, 12), men vores komplette kort identificerer E406W som en cocktailflugtsmutation.E406W påvirker REGN-COV2-antistoffet på en relativt specifik måde og interfererer ikke alvorligt med RBD's funktion, fordi det kun reducerer neutraliseringseffekten af LY-CoV016 (Figur 1C) og titeren af pseudotypede lentivirale partikler med spidser (figur 1C) S3F).
For at undersøge, om vores flugtkort er i overensstemmelse med udviklingen af vira under antistofselektion, tjekkede vi først dataene fra Regeneron-virusudvælgelseseksperimentet, hvor ekspressionsspidsen blev dyrket i cellekultur i nærværelse af enhver REGN10933 vesikulær stomatitisvirus (VSV), REGN10987 eller REGN-COV2 cocktail (12).Dette arbejde identificerede fem escape-mutationer fra REGN10933, to escape-mutationer fra REGN10987 og ingen mutationer fra cocktail (figur 2A).Mutationerne udvalgt af alle syv cellekulturer er fremhævet i vores flugtkort, og enkeltnukleotidændringen af vildtypekodonen i Wuhan-Hu-1 RBD-sekvensen er også tilgængelig (figur 2B), hvilket indikerer forskellen mellem undslippekonkordans graf og virusudvikling under antistoftryk i cellekultur.Det er værd at bemærke, at E406W ikke kan tilgås af enkelte nukleotidændringer, hvilket kan forklare, hvorfor Regeneron-cocktailudvalget ikke kan identificere det på trods af den relativt gode tolerance for RBD-foldning og ACE2-affinitet.
(A) I nærvær af antistoffer bruger Regeneron panikpseudotype VSV til at udvælge virusudslipsmutationer i cellekultur (12).(B) Flugtdiagrammet, som vist i figur 1A, men viser kun de mutationer, der er tilgængelige ved en enkelt nukleotidændring i Wuhan-Hu-1-sekvensen.Ikke-grå indikerer mutationer i cellekultur (rød) og inficerede patienter (blå) ), eller begge (lilla).Figur S5 viser disse grafer, som er farvet af, hvordan mutationer påvirker ACE2-affinitet eller RBD-ekspression.(C) Kinetik af RBD-mutation hos patienter behandlet med REGN-COV2 på den 145. infektionsdag (sort stiplet lodret linje).Hyppigheden af kobling mellem E484A og F486I steg, men da E484A ikke er en flugtmutation i vores figur, er den ikke vist i andre paneler.Se også figur.S4.(D) Undslipsmutationerne, der forekommer i cellekultur og inficerede patienter, er tilgængelige med et enkelt nukleotid, og bindingen af undslippende antistoffer forårsager ikke nogen større omkostning for ACE2-affinitet [målt ved gærvisningsmetoden (7)].Hvert punkt er en mutation, og dets form og farve indikerer, om det kan tilgås og selekteres under virusvækst.De mere højre punkter på x-aksen indikerer stærkere antistofbindingsudslip;de højere punkter på y-aksen indikerer højere ACE2-affinitet.
For at afgøre, om Escape Atlas kan analysere udviklingen af vira, der inficerer mennesker, undersøgte vi dybe sekventeringsdata fra en vedvarende inficeret immunkompromitteret patient, som modtog REGN-COV2 på den 145. dag efter diagnosen COVID-19-behandling (16).Sen behandling gør det muligt for patientens viruspopulation at akkumulere genetisk diversitet, hvoraf en del kan være drevet af immunstress, fordi patienten har et svagt autoneutraliserende antistofrespons før behandling (16).Efter administration af REGN-COV2 ændrede frekvensen af fem aminosyremutationer i RBD sig hurtigt (figur 2C og figur S4).Vores flugtkort viste, at tre af disse mutationer undslap REGN10933 og en undslap REGN10987 (figur 2B).Det er værd at bemærke, at efter antistofbehandlingen blev ikke alle mutationer overført til det fikserede sted.Tværtimod er der konkurrencens stigning og fald (figur 2C).Dette mønster er blevet observeret i den interne udvikling af de adaptive værter af andre vira (17, 18), muligvis på grund af konkurrence mellem genetisk frikørsel og virale afstamninger.Begge disse kræfter ser ud til at spille en rolle hos patienter med vedvarende infektion (figur 2C og figur S4C): E484A (ikke en flugtmutation i vores diagram) og F486I (escape REGN10933) frikørsel efter behandling, og virusslægter, der bærer N440D og Q493K (undslipper henholdsvis REGN10987 og REGN10933) konkurrerede først med REGN10933-escape-mutanten Y489H og konkurrerede derefter med slægten, der bar E484A og F486I og Q493K.
Tre af de fire undslippemutationer hos patienter behandlet med REGN-COV2 blev ikke identificeret i Regenerons viruscellekulturudvælgelse (figur 2B), hvilket illustrerer fordelen ved det komplette kort.Virusvalg er ufuldstændigt, fordi de kun kan identificere eventuelle mutationer, der er tilfældigt udvalgt i det pågældende cellekultureksperiment.Tværtimod annoterer det komplette kort alle mutationer, som kan omfatte mutationer forårsaget af årsager, der ikke er relateret til behandling, men som ved et uheld påvirker antistofbinding.
Naturligvis er udviklingen af vira påvirket af funktionelle begrænsninger og pres for at undgå antistoffer.Mutationerne og patienterne udvalgt i cellekultur opfylder altid følgende kriterier: de undslipper antistofbinding, kan trænge ind gennem en enkelt nukleotidændring og har ringe eller ingen omkostninger til ACE2-affinitet [gennem de tidligere dybe mutationer vist ved hjælp af gær-scanning-måling RBD (7 )] (Figur 2D og Figur S5).Derfor kan et komplet kort over, hvordan mutationer påvirker vigtige biokemiske fænotyper af RBD (såsom ACE og antistofbinding) bruges til at vurdere mulige veje for virusudvikling.En advarsel er, at i en længere evolutionær tidsramme, som observeret i viral immunitet og lægemiddelflugt, på grund af epistatiske interaktioner, kan tolerancerummet for mutationer ændre sig (19-21).
Det komplette kort giver os mulighed for at evaluere de eksisterende flugtmutationer i den cirkulerende SARS-CoV-2.Vi kontrollerede alle tilgængelige human-afledte SARS-CoV-2-sekvenser pr. 11. januar 2021 og fandt ud af, at et stort antal RBD-mutationer undslap et eller flere antistoffer (figur 3).Den eneste escape-mutation, der er til stede i >0,1 % af sekvensen, er REGN10933 escape-mutant Y453F [0,3 % af sekvensen;se (12)], REGN10987 undslipper mutant N439K [1,7% af sekvensen;se figur 1C og (22)], og LY-CoV016 undslipper mutation K417N (0,1 % sekvens; se også figur 1C).Y453F er forbundet med uafhængige udbrud relateret til minkfarme i Holland og Danmark (23, 24);det er værd at bemærke, at selve minksekvensen nogle gange indeholder andre flugtmutationer, såsom F486L (24).N439K er meget populær i Europa, og udgør en stor del af sekvensen fra Skotland og Irland i Europa (22, 25).K417N findes i B.1.351-slægten, som først blev opdaget i Sydafrika (10).En anden mutation af aktuelle bekymring er N501Y, som er til stede i B.1.351 og også i B.1.1.7-slægten, der oprindeligt blev identificeret i Storbritannien (9).Vores kort viser, at N501Y ikke har nogen effekt på REGN-COV2 antistof, men kun moderat effekt på LY-CoV016 (figur 3).
For hver antistof- eller antistofkombination pr. 11. januar 2021 blandt de 317.866 højkvalitets human-afledte SARS-CoV-2-sekvenser på GISAID (26), forholdet mellem escape-score for hver mutation og dens hyppighed.Det er markeret.REGN-COV2 cocktail-escape-mutationen E406W kræver flere nukleotidændringer i Wuhan-Hu-1 RBD-sekvensen og observeres ikke i GISAID-sekvensen.Andre mutationer af rest E406 (E406Q og E406D) blev observeret med lavfrekvent tælling, men disse mutante aminosyrer er ikke enkelte nukleotidmutationer langt væk fra W.
Som forventet forekommer escape-mutationer normalt i antistof-RBD-grænsefladen.Struktur alene er dog ikke nok til at forudsige, hvilke mutationer der formidler undslippe.For eksempel bruger LY-CoV016 sine tunge og lette kæder til at binde til en bred epitop, der overlapper ACE2-bindingsoverfladen, men flugtprocessen involverer mutationer i RBD-rester i den tunge kæde-komplementaritetsbestemmende region (Figur 4A og Figur S6, E til G).I modsætning hertil forekom escapes fra REGN10933 og REGN10987 hovedsageligt ved RBD-rester stablet ved grænsefladen mellem antistoftunge og lette kæder (figur 4A og figur S6, A til D).E406W-mutationen, der undslap REGN-COV2-blandingen, forekom ved rester, der ikke var i kontakt med nogen af antistofferne (figur 4, A og B).Selvom E406 er strukturelt tættere på LY-CoV016 (Figur 4B og Figur S6H), har E406W-mutationen en meget mindre effekt på antistoffet (Figur 1, B og C), hvilket indikerer, at den specifikke langrækkende strukturelle mekanisme er anti-REGN - COV2-antistof (figur S6I).Sammenfattende medierer mutationer ved RBD-rester i kontakt med antistoffer ikke altid flugt, og nogle signifikante undslippelsesmutationer forekommer ved rester, der ikke er i kontakt med antistoffer (figur 4B og figur S6, D og G).
(A) Flugtdiagrammet projiceret på RBD-strukturen bundet af antistoffet.[REGN10933 og REGN10987: Proteindatabase (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].De variable domæner af de tunge og lette kæder af antistoffet er vist som blå tegneserier, og farven på overfladen af RBD angiver styrken af den mutationsmedierede flugt på dette sted (hvid indikerer ingen flugt, og rød indikerer den stærkeste antistoffets eller blandingens flugtsted).Websteder, der ikke er funktionelt muterede, er nedtonet.(B) For hvert antistof klassificeres stedet som direkte antistofkontakt (ikke-hydrogenatomer inden for 4Å af antistoffet), proksimalt antistof (4 til 8Å) eller distalt antistof (> 8Å).Hvert punkt repræsenterer et sted, opdelt i escape (rød) eller non-escape (sort).Den grå stiplede linje repræsenterer den kritiske værdi, der bruges til at klassificere stedet som flugt eller ikke-udslip (for detaljer, se Materialer og metoder).De røde og sorte tal angiver, hvor mange steder i hver kategori, der er escaped eller unescaped.
I denne undersøgelse har vi fuldstændig kortlagt de mutationer, der unddrager sig de tre store anti-SARS-CoV-2 antistoffer.Disse kort indikerer, at den tidligere karakterisering af undslippemutationer er ufuldstændig.Hverken enkelte aminosyremutationer, der kan undslippe de to antistoffer i REGN-COV2-cocktailen, er blevet identificeret, og de har heller ikke identificeret størstedelen af vedvarende infektionspatienter behandlet med cocktailen.mutation.Selvfølgelig har vores kort endnu ikke besvaret det mest presserende spørgsmål: Vil SARS-CoV-2 udvikle omfattende resistens over for disse antistoffer?Men det, der er sikkert, er, at det er bekymrende, at så mange undslippemutationer har ringe effekt på RBD-foldning eller receptoraffinitet, og der er allerede nogle lavniveau-mutationer i cirkulerende vira.I sidste ende er det nødvendigt at vente og observere, hvilke mutationer SARS-CoV-2 vil overføre, når det spredes blandt befolkningen.Vores arbejde vil hjælpe "observation" ved straks at forklare virkningen af mutationer klassificeret ved viral genomovervågning.
Dette er en artikel med åben adgang distribueret under vilkårene i Creative Commons Attribution License.Artiklen tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie under forudsætning af, at det originale værk er korrekt citeret.
Bemærk: Vi beder dig kun om at oplyse din e-mailadresse, så den person, du anbefaler til siden, ved, at du ønsker, at de skal se e-mailen, og at det ikke er spam.Vi vil ikke fange nogen e-mailadresser.
Dette spørgsmål bruges til at teste, om du er en besøgende og forhindre automatisk indsendelse af spam.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Det komplette kort over SARS-CoV-2-mutationer, der undslipper den monoklonale antistofblanding fra Regeneron, hjælper med at forklare udviklingen af virussen ved behandling af patienter.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Det komplette kort over SARS-CoV-2-mutationer, der undslipper den monoklonale antistofblanding fra Regeneron, hjælper med at forklare udviklingen af virussen ved behandling af patienter.
©2021 American Association for the Advancement of Science.alle rettigheder forbeholdes.AAAS er partner af HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Indlægstid: 24-2-2021