Varios anticuerpos ya están en uso o en desarrollo como terapias para el tratamiento de la COVID-19.Con la aparición de nuevas variantes del coronavirus 2 de la neumonía asiática (SARS-CoV-2), es importante predecir si seguirán siendo susceptibles a la terapia con anticuerpos.Starr et al.Se utilizó una biblioteca de levadura, que cubre todas las mutaciones en el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 que no alterará fuertemente la unión al receptor del huésped (ACE2), y mapea cómo estas mutaciones afectan a los tres principales anti-SARS-CoV. -2 unión de anticuerpos.Estas figuras identifican mutaciones que escapan a la unión de los anticuerpos, incluidas mutaciones individuales que escapan a los dos anticuerpos en la mezcla de anticuerpos de Regeneron.Muchas mutaciones que escapan a un solo anticuerpo se están propagando en los humanos.
Los anticuerpos son una terapia potencial para el tratamiento del coronavirus 2 de la neumonía asiática (SARS-CoV-2), pero no está claro que el virus se desarrolle para escapar de su riesgo.Aquí, mapeamos cómo todas las mutaciones en el dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2 afectan la unión del cóctel REGN-COV2 al anticuerpo LY-CoV016.Estos mapas completos revelaron una mutación de aminoácidos que evadió por completo la mezcla REGN-COV2, que está compuesta por dos anticuerpos REGN10933 y REGN10987 que se dirigen a diferentes epítopos estructurales.Estas cifras también identifican mutaciones del virus seleccionadas en pacientes infectados persistentemente tratados con REGN-COV2 y durante la selección de escape del virus in vitro.Finalmente, estas cifras revelan que las mutaciones que escapan a un solo anticuerpo ya están presentes en las cepas circulantes del SARS-CoV-2.Estos mapas de escape completos pueden explicar las consecuencias de las mutaciones observadas durante la vigilancia del virus.
Se están desarrollando anticuerpos para tratar el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) (1).Los anticuerpos contra otros virus determinados pueden volverse ineficaces debido a mutaciones virales seleccionadas durante el tratamiento de pacientes infectados (2, 3) o mutaciones virales que se han extendido globalmente para conferir resistencia a todo el clado viral.Por lo tanto, determinar qué mutaciones del SARS-CoV-2 pueden escapar a los anticuerpos clave es fundamental para evaluar cómo las mutaciones observadas durante la vigilancia del virus afectan la eficacia de la terapia con anticuerpos.
La mayoría de los principales anticuerpos anti-SARS-CoV-2 se dirigen al dominio de unión al receptor viral (RBD), que media la unión al receptor de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) (5, 6).Recientemente, hemos desarrollado un método de escaneo profundo de mutaciones para mapear cómo todas las mutaciones de RBD afectan su función y reconocimiento por parte de los anticuerpos antivirales (7, 8).El método implica crear una biblioteca de mutantes de RBD, expresarlos en la superficie de la levadura y utilizar clasificación celular activada por fluorescencia y secuenciación profunda para cuantificar cómo cada mutación afecta el plegamiento de RBD, la afinidad de ACE2 (medida en una serie de titulación) y la unión de anticuerpos. (Figura S1A).En este estudio, utilizamos la biblioteca de mutantes repetitivos descrita en (7), que se compone de variantes de RBD con códigos de barras, que cubren 3804 de las 3819 posibles mutaciones de aminoácidos.Nuestra biblioteca se preparó a partir de los antecedentes genéticos de RBD del primer aislado Wuhan-Hu-1.Aunque la frecuencia de varios mutantes está aumentando, todavía representan las secuencias de RBD más comunes (9, 10).Hemos dibujado dos de 2034 mutaciones que no alteran fuertemente el plegamiento de RBD y la unión de ACE (7), cómo pasar el cóctel REGN-COV2 (REGN10933 y REGN10987) (11, 12) y LY-CoV016 de Eli Lilly. La forma recombinante del El anticuerpo afecta el método de unión del anticuerpo (también llamado CB6 o JS016) (13) (Figura S1B).REGN-COV2 recibió recientemente una autorización de uso de emergencia para COVID-19 (14), mientras que LY-CoV016 se encuentra actualmente en ensayos clínicos de fase 3 (15).
[Glu406→Trp(E406W)] escapó fuertemente de la mezcla de dos anticuerpos (Figura 1A).El mapa de escape de LY-CoV016 también reveló muchas mutaciones de escape en diferentes sitios en RBD (Figura 1B).Aunque algunas mutaciones de escape pueden afectar la capacidad de RBD para unirse a ACE2 o expresarse en una forma plegada apropiadamente, según mediciones previas de escaneo de mutaciones profundas utilizando RBD mostrado en levadura, muchas mutaciones funcionales tienen poco o ningún efecto sobre estas propiedades funcionales (7 ) (La Figura 1, A y B representan la pérdida de afinidad de ACE2, mientras que la Figura S2 representa la disminución en la expresión de RBD.
(A) Mapeo del anticuerpo en REGN-COV2.El gráfico de líneas de la izquierda muestra el escape en cada sitio del RBD (la suma de todas las mutaciones en cada sitio).La imagen del logotipo a la derecha muestra la ubicación de escape fuerte (subrayado morado).La altura de cada letra es proporcional a la fuerza del escape mediado por la mutación del aminoácido, y una “puntuación de escape” de 1 para cada mutación corresponde a un escape completo.La escala del eje y es diferente para cada fila, por lo que, por ejemplo, E406W escapa a todos los anticuerpos REGN, pero es más obvio para los cócteles porque se ve abrumado por los otros sitios de escape de anticuerpos individuales.Para la versión escalable, S2, A y B se utilizan para colorear el mapa según cómo las mutaciones afectan la expresión de RBD plegado.S2, C y D se utilizan para distribuir la influencia sobre la afinidad de ACE2 y la expresión de RBD entre todas las mutaciones observadas en los aislados de virus circulantes.(B) Como se muestra en (A), dibuje LY-CoV016.(C) Utilice partículas lentivirales pseudotipadas con picos para verificar mutaciones clave en el ensayo de neutralización.Elegimos verificar las mutaciones que se predice que tendrán un mayor impacto o existirán con alta frecuencia en los aislados de SARS-CoV-2 (como el N439K) en circulación.Cada punto representa el aumento de la concentración inhibitoria media (CI50) de la mutación en relación con el pico del tipo salvaje (WT) no mutado que contiene D614G.La línea discontinua azul 1 representa un efecto de neutralización similar al WT, y un valor > 1 representa una mayor resistencia a la neutralización.El color del punto indica si quieres escapar del mapa.Los puntos indican que como el IC50 está fuera de la serie de dilución utilizada, se verifica el cambio múltiple (límite superior o inferior).La mayoría de los mutantes se prueban por duplicado, por lo que hay dos puntos.La curva de neutralización completa se muestra en la Figura 2. S3.Las abreviaturas de una letra de los residuos de aminoácidos son las siguientes: A, Ala;C, cisteína;D, áspid;E, Glú;F, Phe;G, Gly;H, el suyo;yo, ile;K, lisina;L, Liu;Metrópolis N, Assen;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptófano;e Y, Tyr.
Para verificar el efecto antigénico de las mutaciones clave, realizamos un ensayo de neutralización utilizando partículas lentivirales pseudotipadas en panícula y descubrimos que había una coherencia entre el mapa de escape de unión del anticuerpo y el ensayo de neutralización (Figura 1C y Figura S3).Como se esperaba del mapa de anticuerpos REGN-COV2, la mutación en la posición 486 solo es neutralizada por REGN10933, mientras que la mutación en las posiciones 439 y 444 solo es neutralizada por REGN10987, por lo que estas mutaciones no pueden escapar.Pero E406W escapó de los dos anticuerpos REGN-COV2, por lo que también escapó con fuerza de la mezcla.A través del análisis estructural y la selección de escape del virus, Regeneron cree que ninguna mutación de aminoácido puede escapar de los dos anticuerpos en el cóctel (11, 12), pero nuestro mapa completo identifica a E406W como una mutación de escape del cóctel.E406W afecta el anticuerpo REGN-COV2 de una manera relativamente específica y no interfiere seriamente con la función de RBD, porque solo reduce ligeramente el efecto de neutralización de LY-CoV016 (Figura 1C) y el título de partículas lentivirales pseudotipadas enriquecidas (Figura S3F).
Para explorar si nuestro mapa de escape es consistente con la evolución de los virus bajo selección de anticuerpos, primero verificamos los datos del experimento de selección de escape del virus Regeneron, en el que el pico de expresión se cultivó en cultivo celular en presencia de cualquier REGN10933. virus de la estomatitis (VSV), REGN10987 o cóctel REGN-COV2 (12).Este trabajo identificó cinco mutaciones de escape de REGN10933, dos mutaciones de escape de REGN10987 y ninguna mutación del cóctel (Figura 2A).Las mutaciones seleccionadas por los siete cultivos celulares se resaltan en nuestro mapa de escape, y también se puede acceder al cambio de un solo nucleótido del codón de tipo salvaje en la secuencia RBD de Wuhan-Hu-1 (Figura 2B), lo que indica la diferencia entre los escapes. Gráfico y evolución del virus bajo presión de anticuerpos en cultivo celular.Vale la pena señalar que no se puede acceder a E406W mediante cambios de un solo nucleótido, lo que puede explicar por qué la selección del cóctel Regeneron no puede identificarlo a pesar de la tolerancia relativamente buena del plegamiento de RBD y la afinidad de ACE2.
(A) En presencia de anticuerpos, Regeneron utiliza el pseudotipo VSV de panícula para seleccionar mutaciones de escape del virus en cultivos celulares (12).(B) El diagrama de escape, como se muestra en la Figura 1A, pero solo muestra las mutaciones accesibles mediante un solo cambio de nucleótido en la secuencia Wuhan-Hu-1.El color no gris indica mutaciones en cultivos celulares (rojo) y pacientes infectados (azul), o ambos (púrpura).La Figura S5 muestra estos gráficos, coloreados según cómo las mutaciones afectan la afinidad de ACE2 o la expresión de RBD.(C) Cinética de la mutación RBD en pacientes tratados con REGN-COV2 en el día 145 de la infección (línea vertical punteada negra).La frecuencia de vinculación entre E484A y F486I aumentó, pero dado que E484A no es una mutación de escape en nuestra figura, no se muestra en otros paneles.Ver también figura.S4.(D) Las mutaciones de escape que ocurren en cultivos celulares y pacientes infectados son accesibles mediante un solo nucleótido, y la unión de los anticuerpos de escape no causa ningún costo importante para la afinidad de ACE2 [medida por el método de visualización en levadura (7)].Cada punto es una mutación, y su forma y color indican si se puede acceder a él y seleccionarlo durante el crecimiento del virus.Los puntos más a la derecha en el eje x indican un escape de unión de anticuerpos más fuerte;los puntos más altos en el eje y indican una mayor afinidad por ACE2.
Para determinar si Escape Atlas puede analizar la evolución de los virus que infectan a los humanos, examinamos datos de secuenciación profunda de un paciente inmunodeprimido persistentemente infectado que recibió REGN-COV2 el día 145 después del diagnóstico del tratamiento con COVID-19 (16).El tratamiento tardío permite que la población viral del paciente acumule diversidad genética, parte de la cual puede deberse a estrés inmunológico, porque el paciente tiene una respuesta débil de anticuerpos autoneutralizantes antes del tratamiento (16).Después de la administración de REGN-COV2, la frecuencia de cinco mutaciones de aminoácidos en RBD cambió rápidamente (Figura 2C y Figura S4).Nuestro mapa de escape mostró que tres de estas mutaciones escaparon de REGN10933 y una escapó de REGN10987 (Figura 2B).Vale la pena señalar que después del tratamiento con anticuerpos, no todas las mutaciones se transfirieron al sitio fijo.Por el contrario, se produce un aumento y una caída de la competencia (Figura 2C).Este patrón se ha observado en la evolución interna de los huéspedes adaptativos de otros virus (17, 18), posiblemente debido a la competencia entre linajes virales y parasitados genéticos.Ambas fuerzas parecen desempeñar un papel en pacientes con infección persistente (Figura 2C y Figura S4C): E484A (no es una mutación de escape en nuestro diagrama) y F486I (REGN10933 de escape) que se aprovechan después del tratamiento, y los linajes de virus que portan N440D y Q493K (que escapó de REGN10987 y REGN10933, respectivamente) compitió primero con el mutante de escape Y489H de REGN10933, y luego compitió con el linaje que portaba E484A, F486I y Q493K.
Tres de las cuatro mutaciones de escape en pacientes tratados con REGN-COV2 no se identificaron en la selección de cultivos celulares del virus de Regeneron (Figura 2B), lo que ilustra la ventaja del mapa completo.La selección de virus es incompleta porque sólo pueden identificar cualquier mutación seleccionada al azar en ese experimento de cultivo celular en particular.Por el contrario, el mapa completo anota todas las mutaciones, que pueden incluir mutaciones causadas por motivos no relacionados con el tratamiento, pero que afectan accidentalmente la unión de los anticuerpos.
Por supuesto, la evolución de los virus se ve afectada por limitaciones funcionales y presión para evadir los anticuerpos.Las mutaciones y los pacientes seleccionados en cultivo celular siempre cumplen con los siguientes criterios: escapan a la unión de anticuerpos, pueden ingresar a través de un solo cambio de nucleótido y tienen poco o ningún costo para la afinidad ACE2 [a través de las mutaciones profundas anteriores mostradas usando la medición de escaneo de levadura RBD (7 )] (Figura 2D y Figura S5).Por lo tanto, se puede utilizar un mapa completo de cómo las mutaciones afectan los fenotipos bioquímicos clave de RBD (como la ECA y la unión de anticuerpos) para evaluar posibles vías de evolución del virus.Una advertencia es que en un marco de tiempo evolutivo más largo, como se observa en la inmunidad viral y el escape de fármacos, debido a interacciones epistáticas, el espacio de tolerancia para las mutaciones puede cambiar (19-21).
El mapa completo nos permite evaluar las mutaciones de escape existentes en el SARS-CoV-2 circulante.Verificamos todas las secuencias de SARS-CoV-2 de origen humano disponibles al 11 de enero de 2021 y descubrimos que una gran cantidad de mutaciones de RBD escaparon a uno o más anticuerpos (Figura 3).Sin embargo, la única mutación de escape presente en >0,1% de la secuencia es el mutante de escape Y453F REGN10933 [0,3% de la secuencia;ver (12)], mutante de escape N439K de REGN10987 [1,7% de la secuencia;consulte la Figura 1C y (22)], y la mutación de escape K417N de LY-CoV016 (secuencia del 0,1 %; consulte también la Figura 1C).Y453F está asociado con brotes independientes relacionados con granjas de visones en los Países Bajos y Dinamarca (23, 24);Vale la pena señalar que la propia secuencia de visón a veces contiene otras mutaciones de escape, como F486L (24).N439K es muy popular en Europa y constituye una gran parte de la secuencia de Escocia e Irlanda en Europa (22, 25).K417N existe en el linaje B.1.351 descubierto por primera vez en Sudáfrica (10).Otra mutación que preocupa actualmente es la N501Y, que está presente en B.1.351 y también en el linaje B.1.1.7 identificado originalmente en el Reino Unido (9).Nuestro mapa muestra que N501Y no tiene ningún efecto sobre el anticuerpo REGN-COV2, pero solo un efecto moderado sobre LY-CoV016 (Figura 3).
Para cada anticuerpo o combinación de anticuerpos, al 11 de enero de 2021, entre las 317,866 secuencias de SARS-CoV-2 de alta calidad de origen humano en GISAID (26), se determinó la relación entre la puntuación de escape para cada mutación y su frecuencia.Está marcado.La mutación de escape del cóctel REGN-COV2 E406W requiere múltiples cambios de nucleótidos en la secuencia RBD de Wuhan-Hu-1 y no se observa en la secuencia GISAID.Se observaron otras mutaciones del residuo E406 (E406Q y E406D) con recuentos de baja frecuencia, pero estos aminoácidos mutantes no son mutaciones de un solo nucleótido muy alejadas de W.
Como era de esperar, las mutaciones de escape suelen ocurrir en la interfaz anticuerpo-RBD.Sin embargo, la estructura por sí sola no es suficiente para predecir qué mutaciones median el escape.Por ejemplo, LY-CoV016 utiliza sus cadenas pesada y ligera para unirse a un epítopo amplio que se superpone a la superficie de unión de ACE2, pero el proceso de escape implica mutaciones en los residuos de RBD en la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (Figura 4A y Figura S6, E a GRAMO).Por el contrario, los escapes de REGN10933 y REGN10987 se produjeron principalmente en los residuos de RBD apilados en la interfaz de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo (Figura 4A y Figura S6, A a D).La mutación E406W que escapó de la mezcla REGN-COV2 ocurrió en residuos que no estaban en contacto con ninguno de los anticuerpos (Figura 4, A y B).Aunque E406 está estructuralmente más cerca de LY-CoV016 (Figura 4B y Figura S6H), la mutación E406W tiene un efecto mucho menor en el anticuerpo (Figura 1, B y C), lo que indica que el mecanismo estructural específico de largo alcance es anti-REGN. - Anticuerpo COV2 (Figura S6I).En resumen, las mutaciones en los residuos de RBD en contacto con los anticuerpos no siempre median el escape, y algunas mutaciones de escape significativas ocurren en los residuos que no están en contacto con los anticuerpos (Figura 4B y Figura S6, D y G).
(A) El diagrama de escape proyectado en la estructura RBD unida por el anticuerpo.[REGN10933 y REGN10987: Base de datos de proteínas (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se muestran como dibujos animados azules, y el color en la superficie del RBD indica la fuerza del escape mediado por mutación en este sitio (el blanco indica que no hay escape y el rojo indica el más fuerte). sitio de escape del anticuerpo o mezcla).Los sitios que no están funcionalmente mutados aparecen atenuados.(B) Para cada anticuerpo, clasifique el sitio como contacto directo del anticuerpo (átomos no de hidrógeno dentro de 4 Å del anticuerpo), anticuerpo proximal (4 a 8 Å) o anticuerpo distal (> 8 Å).Cada punto representa un sitio, dividido en escape (rojo) o no escape (negro).La línea discontinua gris representa el valor crítico utilizado para clasificar el sitio como de escape o sin escape (para más detalles, consulte Materiales y métodos).Los números rojos y negros indican cuántos sitios de cada categoría tienen escape o no.
En este estudio, hemos mapeado completamente las mutaciones que evaden los tres anticuerpos anti-SARS-CoV-2 principales.Estos mapas indican que la caracterización previa de las mutaciones de escape es incompleta.No se han identificado mutaciones de aminoácidos individuales que puedan escapar de los dos anticuerpos en el cóctel REGN-COV2, ni han identificado a la mayoría de los pacientes con infección persistente tratados con el cóctel.mutación.Por supuesto, nuestro mapa aún no ha respondido a la pregunta más apremiante: ¿desarrollará el SARS-CoV-2 una resistencia extensa a estos anticuerpos?Pero lo que es seguro es que resulta preocupante que tantas mutaciones de escape tengan poco efecto sobre el plegamiento de RBD o la afinidad del receptor, y ya existen algunas mutaciones de bajo nivel en los virus circulantes.Al final, hay que esperar y observar qué mutaciones transmitirá el SARS-CoV-2 cuando se propague entre la población.Nuestro trabajo ayudará a la “observación” al explicar inmediatamente el impacto de las mutaciones clasificadas por la vigilancia del genoma viral.
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El mapa completo de las mutaciones del SARS-CoV-2 que escapan a la mezcla de anticuerpos monoclonales de Regeneron ayuda a explicar la evolución del virus en el tratamiento de los pacientes.
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Hora de publicación: 24 de febrero de 2021