Mitmed antikehad on COVID-19 ravimeetoditena juba kasutusel või väljatöötamisel.Raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviiruse 2 (SARS-CoV-2) uute variantide ilmnemisel on oluline ennustada, kas need on endiselt vastuvõtlikud antikehade ravile.Starr et al.Kasutati pärmi raamatukogu, mis hõlmab kõiki SARS-CoV-2 retseptori sidumisdomeeni mutatsioone, mis ei häiri tugevalt peremeesretseptoriga (ACE2) seondumist, ja kaardistab, kuidas need mutatsioonid mõjutavad kolme peamist SARS-CoV-vastast toimet. -2 antikeha sidumine.Need arvud tuvastavad mutatsioonid, mis väldivad antikehade sidumist, sealhulgas üksikud mutatsioonid, mis pääsevad Regeneroni antikehade segu kahest antikehast välja.Paljud mutatsioonid, mis pääsevad ühest antikehast, levivad inimestel.
Antikehad on potentsiaalne ravi raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2 (SARS-CoV-2) raviks, kuid pole selge, kas viirus areneb välja, et pääseda nende riskist.Siin kaardistame, kuidas kõik SARS-CoV-2 retseptori sidumisdomeeni (RBD) mutatsioonid mõjutavad REGN-COV2 kokteili seondumist antikehaga LY-CoV016.Need täielikud kaardid näitasid aminohappe mutatsiooni, mis vältis täielikult REGN-COV2 segu, mis koosneb kahest antikehast REGN10933 ja REGN10987, mis on suunatud erinevatele struktuursetele epitoopidele.Need arvud tuvastavad ka viirusmutatsioonid, mis on valitud püsivalt nakatunud patsientidel, keda raviti REGN-COV2-ga, ja in vitro viiruse põgenemise valiku ajal.Lõpuks näitavad need arvud, et tsirkuleerivates SARS-CoV-2 tüvedes esinevad juba mutatsioonid, mis põgenevad ühest antikehast.Need täielikud põgenemiskaardid võivad selgitada viiruse jälgimise ajal täheldatud mutatsioonide tagajärgi.
Antikehi töötatakse välja raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviiruse 2 (SARS-CoV-2) raviks (1).Teatud teiste viiruste vastased antikehad võivad muutuda ebaefektiivseks viirusmutatsioonide tõttu, mis on valitud nakatunud patsientide ravi ajal (2, 3), või viirusmutatsioonide tõttu, mis on levinud ülemaailmselt, et anda resistentsus kogu viiruse kladile.Seetõttu on oluline kindlaks teha, millised SARS-CoV-2 mutatsioonid võivad võtmeantikehadest pääseda, et hinnata, kuidas viiruse seire käigus täheldatud mutatsioonid mõjutavad antikeharavi tõhusust.
Enamik juhtivaid SARS-CoV-2-vastaseid antikehi on suunatud viiruse retseptori sidumisdomeenile (RBD), mis vahendab seondumist angiotensiini konverteeriva ensüümi 2 (ACE2) retseptoriga (5, 6).Hiljuti oleme välja töötanud sügava mutatsiooni skaneerimise meetodi, et kaardistada, kuidas kõik RBD mutatsioonid mõjutavad selle funktsiooni ja äratundmist viirusevastaste antikehade poolt (7, 8).Meetod hõlmab RBD mutantide raamatukogu loomist, nende ekspresseerimist pärmi pinnal ning fluorestsents-aktiveeritud rakkude sortimise ja sügava sekveneerimise kasutamist, et kvantifitseerida, kuidas iga mutatsioon mõjutab RBD voltimist, ACE2 afiinsust (mõõdetakse tiitrimisseerias) ja antikehade seondumist. (Joonis S1A).Selles uuringus kasutasime punktis (7) kirjeldatud korduvat mutantide raamatukogu, mis koosneb vöötkoodiga RBD variantidest, hõlmates 3804 võimalikust 3819 aminohappe mutatsioonist.Meie raamatukogu valmistati varajase isolaadi Wuhan-Hu-1 RBD geneetilise tausta põhjal.Kuigi mitmete mutantide esinemissagedus kasvab, esindavad nad endiselt kõige levinumaid RBD järjestusi (9, 10).Oleme joonistanud kaks 2034 mutatsioonist, mis ei häiri tugevalt RBD voltimist ja ACE sidumist (7), kuidas REGN-COV2 kokteili (REGN10933 ja REGN10987) (11, 12) ja Eli Lilly LY-CoV016 rekombinantset vormi läbida. antikeha mõjutab antikeha (nimetatakse ka CB6 või JS016) sidumise meetodit (13) (joonis S1B).REGN-COV2-le anti hiljuti luba COVID-19 hädaolukorras kasutamiseks (14), samas kui LY-CoV016 puhul on praegu käimas 3. faasi kliinilised uuringud (15).
[Glu406 → Trp(E406W)] pääses kahe antikeha segust tugevalt välja (joonis 1A).LY-CoV016 põgenemiskaart näitas ka palju põgenemismutatsioone RBD erinevates kohtades (joonis 1B).Kuigi mõned põgenemismutatsioonid võivad kahjustada RBD võimet seostuda ACE2-ga või ekspresseeruda sobivalt volditud kujul, on varasemate pärmiga kuvatud RBD-ga sügava mutatsiooni skaneerimise mõõtmiste kohaselt paljudel funktsionaalsetel mutatsioonidel nendele funktsionaalsetele omadustele väike mõju või puudub üldse mõju (7). ) (Joonis 1, A ja B kujutavad ACE2 afiinsuse kadumist, samas kui joonis S2 kujutab RBD ekspressiooni vähenemist.
(A) REGN-COV2 antikeha kaardistamine.Vasakpoolne joondiagramm näitab põgenemist veekogu igas kohas (kõikide mutatsioonide summa igas kohas).Parempoolne logokujutis näitab tugevat põgenemiskohta (lilla allajoon).Iga tähe kõrgus on võrdeline aminohappemutatsiooni poolt vahendatud põgenemise tugevusega ja iga mutatsiooni "põgenemisskoor" 1 vastab täielikule põgenemisele.Y-telje skaala on iga rea jaoks erinev, nii et näiteks E406W põgeneb kõigist REGN-i antikehadest, kuid kokteilide puhul on see kõige ilmsem, kuna see on ülekoormatud üksikute antikehade teiste põgenemiskohtade poolt.Skaleeritava versiooni puhul kasutatakse S2, A ja B kaardi värvimiseks selle järgi, kuidas mutatsioonid mõjutavad volditud RBD ekspressiooni.S2, C ja D kasutatakse ACE2 afiinsuse ja RBD ekspressiooni mõju jaotamiseks kõigi ringlevates viirusisolaatides täheldatud mutatsioonide vahel.(B) Nagu näidatud punktis (A), joonistage LY-CoV016.(C) Kasutage neutraliseerimisanalüüsi võtmemutatsioonide kontrollimiseks pseudotüübiga lentiviiruse osakesi.Otsustasime kontrollida mutatsioone, millel on eeldatavasti suurem mõju või mis esinevad kõrge sagedusega SARS-CoV-2 isolaatides (nagu N439K) vereringes.Iga punkt tähistab mutatsiooni keskmise inhibeeriva kontsentratsiooni (IC50) kordamist võrreldes D614G-d sisaldava muteerimata metsiktüüpi (WT) tipuga.Sinine katkendjoon 1 tähistab WT-ga sarnast neutraliseerimisefekti ja väärtus> 1 tähistab suurenenud neutraliseerimistakistust.Punkti värv näitab, kas soovite kaardilt põgeneda.Täpid näitavad, et kuna IC50 on väljaspool kasutatavat lahjendusseeriat, kontrollitakse mitmekordset muutust (ülemine või alumine piir).Enamikku mutante testitakse kahes eksemplaris, seega on kaks punkti.Täielik neutraliseerimiskõver on näidatud joonisel 2. S3.Aminohappejääkide ühetähelised lühendid on järgmised: A, Ala;C, tsüsteiin;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, tema;mina, Ile;K, lüsiin;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gin;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, trüptofaan;ja Y, Tyr.
Võtmemutatsioonide antigeense toime kontrollimiseks teostasime neutraliseerimistesti, kasutades paanika pseudotüübiga lentiviiruse osakesi, ja leidsime, et antikehade sidumise põgenemiskaardi ja neutraliseerimistesti vahel oli järjepidevus (joonis 1C ja joonis S3).Nagu REGN-COV2 antikehakaardilt eeldati, neutraliseerib positsiooni 486 mutatsiooni ainult REGN10933, samas kui positsioonide 439 ja 444 mutatsiooni neutraliseerib ainult REGN10987, nii et need mutatsioonid ei saa põgeneda.Kuid E406W pääses kahest REGN-COV2 antikehast välja, seega pääses see ka segust tugevalt välja.Regeneron usub struktuuranalüüsi ja viiruse põgenemise valiku kaudu, et ükski aminohappe mutatsioon ei pääse kokteili kahest antikehast (11, 12), kuid meie täielik kaart tuvastab E406W kui kokteili põgenemismutatsiooni.E406W mõjutab REGN-COV2 antikeha suhteliselt spetsiifilisel viisil ega häiri tõsiselt RBD funktsiooni, kuna see vähendab vaid veidi LY-CoV016 neutraliseerivat toimet (joonis 1C) ja pseudotüüpsete lentiviiruse osakeste tiitrit (joonis). S3F).
Uurimaks, kas meie põgenemiskaart on kooskõlas antikehade selektsiooni all olevate viiruste evolutsiooniga, kontrollisime esmalt Regeneroni viiruse põgenemise selektsiooni katse andmeid, kus ekspressioonipiiki kasvatati rakukultuuris mis tahes REGN10933 juuresolekul. stomatiidi viirus (VSV), REGN10987 või REGN-COV2 kokteil (12).See töö tuvastas viis põgenemismutatsiooni REGN10933-st, kaks põgenemismutatsiooni REGN10987-st ja ühtegi mutatsiooni kokteilist (joonis 2A).Kõigi seitsme rakukultuuri valitud mutatsioonid on meie põgenemiskaardil esile tõstetud ja Wuhan-Hu-1 RBD järjestuse metsiktüüpi koodoni ühe nukleotiidi muutus on samuti kättesaadav (joonis 2B), mis näitab erinevust põgenemiste vahel. graafik ja viiruse evolutsioon antikeha rõhu all rakukultuuris.Väärib märkimist, et E406W-le ei pääse juurde ühe nukleotiidi muutmisega, mis võib selgitada, miks Regeneroni kokteilivalik ei suuda seda tuvastada, hoolimata suhteliselt heast RBD voltimise ja ACE2 afiinsuse taluvusest.
(A) Antikehade juuresolekul kasutab Regeneron panicle pseudotüüpi VSV-d, et valida rakukultuuris viiruse põgenemismutatsioonid (12).(B) Põgenemisdiagramm, nagu on näidatud joonisel 1A, kuid näitab ainult mutatsioone, mis on kättesaadavad ühe nukleotiidi muutusega Wuhan-Hu-1 järjestuses.Mittehall tähistab mutatsioone rakukultuuris (punane) ja nakatunud patsientidel (sinine) või mõlemas (lilla).Joonis S5 näitab neid graafikuid, mis on värvitud selle järgi, kuidas mutatsioonid mõjutavad ACE2 afiinsust või RBD ekspressiooni.(C) RBD mutatsiooni kineetika patsientidel, keda raviti REGN-COV2-ga nakatumise 145. päeval (must punktiir vertikaalne joon).E484A ja F486I vahelise seose sagedus suurenes, kuid kuna E484A ei ole meie joonisel põgenemismutatsioon, pole seda teistel paneelidel näidatud.Vaata ka joonist.S4.(D) Rakukultuuris ja nakatunud patsientidel esinevad põgenemismutatsioonid on ligipääsetavad ühe nukleotiidiga ning põgenemisantikehade seondumine ei põhjusta ACE2 afiinsusele suuri kulutusi [mõõdetuna pärmi kuvamismeetodiga (7)].Iga punkt on mutatsioon ning selle kuju ja värv näitavad, kas sellele on võimalik viiruse kasvu ajal juurde pääseda ja valida.Rohkem parempoolseid punkte x-teljel näitavad tugevamat antikeha sidumise põgenemist;y-telje kõrgemad punktid näitavad kõrgemat ACE2 afiinsust.
Et teha kindlaks, kas Escape Atlas suudab analüüsida inimesi nakatavate viiruste arengut, uurisime süvajärjestuse andmeid püsivalt nakatunud immuunpuudulikkusega patsiendilt, kes sai REGN-COV2 145. päeval pärast COVID-19 ravi diagnoosimist (16).Hiline ravi võimaldab patsiendi viiruspopulatsioonil akumuleerida geneetilist mitmekesisust, millest osa võib olla põhjustatud immuunstressist, kuna patsiendil on enne ravi nõrk autoneutraliseerivate antikehade reaktsioon (16).Pärast REGN-COV2 manustamist muutus viie aminohappe mutatsiooni sagedus RBD-s kiiresti (joonis 2C ja joonis S4).Meie põgenemiskaart näitas, et kolm neist mutatsioonidest pääsesid REGN10933-st ja üks REGN10987-st (joonis 2B).Väärib märkimist, et pärast antikehade töötlemist ei kandunud kõik mutatsioonid fikseeritud kohta üle.Vastupidi, konkurents tõuseb ja langeb (joonis 2C).Seda mustrit on täheldatud teiste viiruste adaptiivsete peremeeste sisemises evolutsioonis (17, 18), mis võib olla tingitud konkurentsist geneetilise vabasõidu ja viiruste liinide vahel.Mõlemad jõud näivad mängivat rolli püsiva infektsiooniga patsientide puhul (joonis 2C ja joonis S4C): E484A (ei ole põgenemismutatsioon meie diagrammil) ja F486I (põgenemine REGN10933) pärast ravi vabasõitu ning N440D-d kandvad viirusliinid. Q493K (põgenes vastavalt REGN10987 ja REGN10933) konkureeris esmalt REGN10933 põgenemismutandiga Y489H ning seejärel konkureeris E484A ja F486I ning Q493K kandva liiniga.
Kolm neljast põgenemismutatsioonist REGN-COV2-ga ravitud patsientidel ei tuvastatud Regeneroni viiruse rakukultuuri valikus (joonis 2B), mis illustreerib täieliku kaardi eeliseid.Viiruse valik on puudulik, kuna need suudavad tuvastada ainult selles konkreetses rakukultuuri katses juhuslikult valitud mutatsioone.Vastupidi, täielik kaart märgib kõik mutatsioonid, mis võivad sisaldada mutatsioone, mis on põhjustatud raviga mitteseotud põhjustest, kuid mõjutavad kogemata antikehade seondumist.
Loomulikult mõjutavad viiruste arengut funktsionaalsed piirangud ja surve antikehadest kõrvale hoida.Rakukultuuris valitud mutatsioonid ja patsiendid vastavad alati järgmistele kriteeriumidele: nad pääsevad antikehade sidumisest, võivad siseneda ühe nukleotiidi muutuse kaudu ja neil on vähe või üldse mitte mingeid kulusid ACE2 afiinsusele [eelmiste sügavate mutatsioonide kaudu, mis on kuvatud pärmi skaneerimise mõõtmise RBD abil (7 )] (joonis 2D ja joonis S5).Seetõttu saab viiruse võimalike evolutsiooniteede hindamiseks kasutada täielikku kaarti selle kohta, kuidas mutatsioonid mõjutavad RBD peamisi biokeemilisi fenotüüpe (nagu ACE ja antikehade sidumine).Üks hoiatus on see, et pikema evolutsioonilise aja jooksul, nagu on täheldatud viiruse immuunsuse ja ravimite põgenemise korral, võib epistaatiliste koostoimete tõttu muutuda mutatsioonide taluvusruum (19–21).
Täielik kaart võimaldab meil hinnata ringleva SARS-CoV-2 olemasolevaid põgenemismutatsioone.Kontrollisime 11. jaanuari 2021 seisuga kõiki saadaolevaid inimeselt saadud SARS-CoV-2 järjestusi ja leidsime, et suur hulk RBD mutatsioone pääses ühest või mitmest antikehast (joonis 3).Ainus põgenemismutatsioon, mis esineb >0,1% järjestusest, on REGN10933 põgenemismutant Y453F [0,3% järjestusest;vt (12)], REGN10987 põgenemismutant N439K [1,7% järjestusest;vt joonis 1C ja (22)] ja LY-CoV016 põgenemismutatsioon K417N (0,1% järjestus; vt ka joonist 1C).Y453F on seotud sõltumatute puhangutega, mis on seotud naaritsafarmidega Hollandis ja Taanis (23, 24);väärib märkimist, et naaritsajärjestus ise sisaldab mõnikord ka muid põgenemismutatsioone, näiteks F486L (24).N439K on Euroopas väga populaarne ja moodustab suure osa Šotimaa ja Iirimaa jadast Euroopas (22, 25).K417N esineb B.1.351 liinis, mis avastati esmakordselt Lõuna-Aafrikas (10).Teine praegu murettekitav mutatsioon on N501Y, mis esineb B.1.351 ja samuti Ühendkuningriigis algselt tuvastatud B.1.1.7 liinis (9).Meie kaart näitab, et N501Y ei mõjuta REGN-COV2 antikeha, kuid mõjutab LY-CoV016 ainult mõõdukalt (joonis 3).
Iga antikeha või antikehade kombinatsiooni 11. jaanuari 2021 seisuga 317 866 kõrgekvaliteedilise inimeselt saadud SARS-CoV-2 järjestuse hulgas GISAIDis (26) on iga mutatsiooni põgenemisskoori ja selle sageduse vaheline seos.See on märgistatud.REGN-COV2 kokteili põgenemismutatsioon E406W nõuab Wuhan-Hu-1 RBD järjestuses mitmeid nukleotiidimuutusi ja seda ei täheldata GISAID järjestuses.Madala sagedusega loendamisel täheldati muid jäägi E406 (E406Q ja E406D) mutatsioone, kuid need mutantsed aminohapped ei ole üksikud nukleotiidi mutatsioonid, mis on W-st kaugel.
Nagu oodatud, esinevad põgenemismutatsioonid tavaliselt antikeha-RBD liideses.Kuid struktuurist üksi ei piisa, et ennustada, millised mutatsioonid vahendavad põgenemist.Näiteks LY-CoV016 kasutab oma raskeid ja kergeid ahelaid, et seonduda laia epitoobiga, mis kattub ACE2 sidumispinnaga, kuid põgenemisprotsess hõlmab mutatsioone RBD jääkides raske ahela komplementaarsust määravas piirkonnas (joonis 4A ja joonis S6, E kuni G).Seevastu REGN10933 ja REGN10987 põgenemised toimusid peamiselt RBD jääkide juures, mis olid virnastatud antikeha raskete ja kergete ahelate liidesele (joonis 4A ja joonis S6, A kuni D).REGN-COV2 segust pääsenud E406W mutatsioon tekkis jääkide juures, mis ei olnud kontaktis kummagi antikehaga (joonis 4, A ja B).Kuigi E406 on struktuurilt lähemal LY-CoV016-le (joonis 4B ja joonis S6H), on E406W mutatsioonil palju väiksem mõju antikehale (joonis 1, B ja C), mis näitab, et spetsiifiline pikamaa struktuurimehhanism on anti-REGN. - COV2 antikeha (joonis S6I).Kokkuvõtteks võib öelda, et antikehadega kokkupuutuvate RBD jääkide mutatsioonid ei vahenda alati põgenemist ja mõned olulised põgenemismutatsioonid esinevad jääkides, mis ei puutu kokku antikehadega (joonis 4B ja joonis S6, D ja G).
(A) Antikehaga seotud RBD struktuurile projitseeritud põgenemisdiagramm.[REGN10933 ja REGN10987: valgu andmebaas (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: esialgse eelarveprojekti ID 7C01 (13)].Antikeha raskete ja kergete ahelate varieeruvad domeenid on kujutatud siniste karikatuuridena ja RBD pinnal olev värv näitab selles kohas mutatsiooni poolt vahendatud põgenemise tugevust (valge näitab, et põgenemist pole ja punane näitab tugevaimat. antikeha või segu põgenemiskoht).Funktsionaalselt muteerunud saidid on hallid.(B) Iga antikeha puhul klassifitseerige koht otseseks kokkupuuteks antikehaga (mittevesiniku aatomid antikehast 4Å raadiuses), proksimaalseks antikehaks (4 kuni 8Å) või distaalseks antikehaks (> 8Å).Iga punkt tähistab saiti, mis on jagatud põgenemiseks (punane) või mittepõgenemiseks (must).Hall katkendjoon tähistab kriitilist väärtust, mida kasutatakse saidi klassifitseerimiseks põgenemiseks või mittepõgenemiseks (üksikasju vt jaotisest Materjalid ja meetodid).Punased ja mustad numbrid näitavad, kui palju saite igas kategoorias on paopaositaga või ilma.
Selles uuringus oleme täielikult kaardistanud mutatsioonid, mis väldivad kolme peamist SARS-CoV-2 vastast antikeha.Need kaardid näitavad, et põgenemismutatsioonide eelmine iseloomustus on puudulik.Ei ole tuvastatud ühtegi aminohappe mutatsiooni, mis pääseks REGN-COV2 kokteili kahest antikehast välja, ega ka enamikku kokteiliga ravitud püsivate infektsioonidega patsiente.mutatsioon.Muidugi pole meie kaart veel vastanud kõige pakilisemale küsimusele: kas SARS-CoV-2 arendab nende antikehade suhtes ulatuslikku resistentsust?Kuid kindel on see, et murettekitav on see, et nii paljudel põgenemismutatsioonidel on vähe mõju RBD voltimisele või retseptori afiinsusele ning ringlevates viirustes on juba mõned madalad mutatsioonid.Lõpuks tuleb oodata ja jälgida, milliseid mutatsioone SARS-CoV-2 elanikkonna seas levides edasi kannab.Meie töö aitab "vaatlust", selgitades kohe viiruse genoomi seirega klassifitseeritud mutatsioonide mõju.
See on avatud juurdepääsuga artikkel, mida levitatakse Creative Commonsi omistamislitsentsi tingimuste alusel.Artikkel lubab piiramatut kasutamist, levitamist ja reprodutseerimist mis tahes kandjatel tingimusel, et originaalteosele viidatakse õigesti.
Märkus. Palume teil sisestada oma e-posti aadress ainult selleks, et lehele soovitav inimene teaks, et soovite, et ta seda meili näeks ja et see pole rämpspost.Me ei jäädvusta ühtegi meiliaadressi.
Seda küsimust kasutatakse selleks, et testida, kas olete külastaja ja vältida rämpsposti automaatset saatmist.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Täielik kaart SARS-CoV-2 mutatsioonidest, mis pääsevad Regeneroni monoklonaalsete antikehade segust, aitab selgitada viiruse arengut patsientide ravimisel.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Täielik kaart SARS-CoV-2 mutatsioonidest, mis pääsevad Regeneroni monoklonaalsete antikehade segust, aitab selgitada viiruse arengut patsientide ravimisel.
©2021 American Association for the Advanced of Science of Science.kõik õigused kaitstud.AAAS on HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ja COUNTER.Science ISSN 1095-9203 partner.
Postitusaeg: 24.02.2021