Plusieurs anticorps sont déjà utilisés ou en cours de développement comme thérapies pour le traitement du COVID-19.Avec l’émergence de nouvelles variantes du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère, il est important de prédire si elles seront toujours sensibles au traitement par anticorps.Starr et coll.Une bibliothèque de levures a été utilisée, qui couvre toutes les mutations du domaine de liaison du récepteur du SRAS-CoV-2 qui ne perturberont pas fortement la liaison au récepteur de l'hôte (ACE2), et cartographie comment ces mutations affectent les trois principaux anti-SRAS-CoV. -2 liaison d'anticorps.Ces chiffres identifient les mutations qui échappent à la liaison des anticorps, y compris les mutations uniques qui échappent aux deux anticorps du mélange d'anticorps Regeneron.De nombreuses mutations qui échappent à un seul anticorps se propagent chez l’homme.
Les anticorps sont une thérapie potentielle pour le traitement du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère, mais il n’est pas clair que le virus se développe pour échapper à leur risque.Ici, nous cartographions comment toutes les mutations du domaine de liaison au récepteur du SRAS-CoV-2 (RBD) affectent la liaison du cocktail REGN-COV2 à l'anticorps LY-CoV016.Ces cartes complètes ont révélé une mutation d’acide aminé qui a complètement échappé au mélange REGN-COV2, composé de deux anticorps REGN10933 et REGN10987 qui ciblent différents épitopes structuraux.Ces chiffres identifient également les mutations virales sélectionnées chez les patients infectés de manière persistante traités par REGN-COV2 et lors de la sélection d’évasion du virus in vitro.Enfin, ces chiffres révèlent que des mutations qui échappent à un seul anticorps sont déjà présentes dans les souches circulantes du SARS-CoV-2.Ces cartes d’évasion complètes peuvent expliquer les conséquences des mutations observées lors de la surveillance du virus.
Des anticorps sont en cours de développement pour traiter le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère (1).Les anticorps contre certains autres virus peuvent être rendus inefficaces par des mutations virales sélectionnées lors du traitement de patients infectés (2, 3) ou par des mutations virales qui se sont propagées à l’échelle mondiale pour conférer une résistance à l’ensemble du clade viral.Par conséquent, il est essentiel de déterminer quelles mutations du SRAS-CoV-2 peuvent échapper aux anticorps clés pour évaluer comment les mutations observées lors de la surveillance du virus affectent l’efficacité du traitement par anticorps.
La plupart des principaux anticorps anti-SARS-CoV-2 ciblent le domaine de liaison au récepteur viral (RBD), qui assure la médiation de la liaison au récepteur de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2) (5, 6).Récemment, nous avons développé une méthode d’analyse approfondie des mutations pour cartographier la manière dont toutes les mutations du RBD affectent sa fonction et sa reconnaissance par les anticorps antiviraux (7, 8).La méthode consiste à créer une bibliothèque de mutants RBD, à les exprimer à la surface de la levure et à utiliser le tri cellulaire activé par fluorescence et le séquençage en profondeur pour quantifier comment chaque mutation affecte le repliement du RBD, l'affinité ACE2 (mesurée dans une série de titrages) et la liaison des anticorps. (Figure S1A).Dans cette étude, nous avons utilisé la bibliothèque de mutants répétitifs décrite dans (7), qui est composée de variantes RBD à code-barres, couvrant 3 804 des 3 819 mutations possibles d’acides aminés.Notre bibliothèque a été préparée à partir du fond génétique RBD du premier isolat Wuhan-Hu-1.Bien que la fréquence de plusieurs mutants augmente, ils représentent toujours les séquences RBD les plus courantes (9, 10).Nous avons dessiné deux des 2034 mutations qui ne perturbent pas fortement le repliement du RBD et la liaison de l'ACE (7) comment transmettre le cocktail REGN-COV2 (REGN10933 et REGN10987) (11, 12) et le LY-CoV016 d'Eli Lilly. La forme recombinante du l’anticorps affecte la méthode de liaison de l’anticorps (également appelé CB6 ou JS016) (13) (Figure S1B).REGN-COV2 a récemment obtenu une autorisation d’utilisation d’urgence pour le COVID-19 (14), tandis que LY-CoV016 fait actuellement l’objet d’essais cliniques de phase 3 (15).
[Glu406 → Trp (E406W)] s'est fortement échappé du mélange de deux anticorps (Figure 1A).La carte d'évasion de LY-CoV016 a également révélé de nombreuses mutations d'évasion sur différents sites du RBD (Figure 1B).Bien que certaines mutations d'échappement puissent altérer la capacité du RBD à se lier à ACE2 ou à s'exprimer sous une forme correctement repliée, selon des mesures antérieures d'analyse de mutations profondes à l'aide de RBD affiché sur levure, de nombreuses mutations fonctionnelles ont peu ou pas d'effet sur ces propriétés fonctionnelles (7 ) (Les figures 1, A et B représentent la perte d'affinité ACE2, tandis que la figure S2 représente la diminution de l'expression de RBD.
(A) Cartographie de l’anticorps dans REGN-COV2.Le graphique linéaire de gauche montre la fuite sur chaque site du RBD (la somme de toutes les mutations sur chaque site).L'image du logo à droite montre l'emplacement de fuite puissant (souligné en violet).La hauteur de chaque lettre est proportionnelle à la force de l’évasion médiée par la mutation de l’acide aminé, et un « score d’évasion » de 1 pour chaque mutation correspond à une évasion complète.L'échelle de l'axe Y est différente pour chaque ligne, ainsi, par exemple, E406W échappe à tous les anticorps REGN, mais c'est plus évident pour les cocktails car il est submergé par les autres sites d'évasion des anticorps individuels.Pour la version évolutive, S2, A et B sont utilisés pour colorer la carte en fonction de la manière dont les mutations affectent l'expression du RBD replié.S2, C et D sont utilisés pour répartir l’influence sur l’affinité ACE2 et l’expression de RBD parmi toutes les mutations observées dans les isolats de virus en circulation.(B) Comme indiqué en (A), dessinez LY-CoV016.(C) Utilisez des particules lentivirales pseudotypées en pointe pour vérifier les mutations clés dans l’analyse de neutralisation.Nous avons choisi de vérifier les mutations qui devraient avoir un plus grand impact ou exister à une fréquence élevée dans les isolats du SRAS-CoV-2 (tels que N439K) en circulation.Chaque point représente le facteur d'augmentation de la concentration médiane inhibitrice (IC50) de la mutation par rapport au pic du type sauvage non muté (WT) contenant D614G.La ligne pointillée bleue 1 représente un effet de neutralisation similaire à WT, et une valeur > 1 représente une résistance de neutralisation accrue.La couleur du point indique si vous souhaitez sortir de la carte.Les points indiquent que la CI50 étant en dehors de la série de dilutions utilisée, le changement multiple est vérifié (limite supérieure ou inférieure).La plupart des mutants sont testés en double, il y a donc deux points.La courbe de neutralisation complète est représentée sur la figure 2. S3.Les abréviations à une lettre des résidus d'acides aminés sont les suivantes : A, Ala ;C, Cystéine;D, Aspe ;E, Glu;F, Phé ;G, Gly;H, le sien ;Moi, Ile ;K, lysine ;L, Liu ;Métropole N, Assen ;P, Pro ;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, tryptophane ;et Y, Tyr.
Afin de vérifier l'effet antigénique des mutations clés, nous avons effectué un test de neutralisation à l'aide de particules lentivirales pseudotypées en panicule et avons constaté qu'il existait une cohérence entre la carte d'échappement de liaison aux anticorps et le test de neutralisation (Figure 1C et Figure S3).Comme prévu d’après la carte des anticorps REGN-COV2, la mutation en position 486 n’est neutralisée que par REGN10933, tandis que la mutation en positions 439 et 444 n’est neutralisée que par REGN10987, donc ces mutations ne peuvent pas s’échapper.Mais E406W a échappé aux deux anticorps REGN-COV2, il s’est donc également fortement échappé du mélange.Grâce à l'analyse structurelle et à la sélection des évasions de virus, Regeneron estime qu'aucune mutation d'acide aminé ne peut échapper aux deux anticorps présents dans le cocktail (11, 12), mais notre carte complète identifie E406W comme une mutation d'évasion du cocktail.E406W affecte l'anticorps REGN-COV2 de manière relativement spécifique et n'interfère pas sérieusement avec le fonctionnement du RBD, car il ne réduit que légèrement l'effet neutralisant du LY-CoV016 (Figure 1C) et le titre de particules lentivirales pseudotypées enrichies (Figure S3F).
Afin de déterminer si notre carte d'évasion est cohérente avec l'évolution des virus sous sélection d'anticorps, nous avons d'abord vérifié les données de l'expérience de sélection d'évasion du virus Regeneron, dans laquelle le pic d'expression a été cultivé en culture cellulaire en présence de tout REGN10933. virus de la stomatite (VSV), cocktail REGN10987 ou REGN-COV2 (12).Ce travail a identifié cinq mutations d'échappement de REGN10933, deux mutations d'échappement de REGN10987 et aucune mutation du cocktail (Figure 2A).Les mutations sélectionnées par les sept cultures cellulaires sont mises en évidence dans notre carte d'évasion, et le changement mononucléotidique du codon de type sauvage dans la séquence Wuhan-Hu-1 RBD est également accessible (Figure 2B), indiquant la différence entre les évasions. graphique et évolution du virus sous pression d’anticorps en culture cellulaire.Il convient de noter que l’E406W n’est pas accessible par des modifications d’un seul nucléotide, ce qui peut expliquer pourquoi la sélection du cocktail Regeneron ne peut pas l’identifier malgré la tolérance relativement bonne du repliement RBD et de l’affinité ACE2.
(A) En présence d’anticorps, Regeneron utilise le pseudotype paniculaire VSV pour sélectionner les mutations d’évasion du virus dans la culture cellulaire (12).(B) Le diagramme d'échappement, comme le montre la figure 1A, montre uniquement les mutations accessibles par un seul changement de nucléotide dans la séquence Wuhan-Hu-1.Les valeurs non grises indiquent des mutations dans la culture cellulaire (rouge) et chez les patients infectés (bleu) ou les deux (violet).La figure S5 montre ces graphiques, qui sont colorés par la manière dont les mutations affectent l'affinité ACE2 ou l'expression du RBD.(C) Cinétique de la mutation RBD chez les patients traités par REGN-COV2 au 145ème jour de l’infection (ligne verticale pointillée noire).La fréquence de liaison entre E484A et F486I a augmenté, mais comme E484A n'est pas une mutation d'échappement dans notre figure, elle n'est pas représentée dans d'autres panels.Voir aussi la figure.S4.(D) Les mutations d'échappement qui se produisent dans la culture cellulaire et les patients infectés sont accessibles par un seul nucléotide, et la liaison des anticorps d'échappement n'entraîne aucun coût majeur pour l'affinité ACE2 [telle que mesurée par la méthode d'affichage de levure (7)].Chaque point est une mutation, et sa forme et sa couleur indiquent s'il est accessible et sélectionné pendant la croissance du virus.Les points les plus à droite sur l’axe des x indiquent une fuite de liaison d’anticorps plus forte ;les points les plus élevés sur l’axe y indiquent une affinité ACE2 plus élevée.
Afin de déterminer si Escape Atlas peut analyser l’évolution des virus infectant les humains, nous avons examiné les données de séquençage approfondi d’un patient immunodéprimé persistant qui a reçu REGN-COV2 le 145e jour après le diagnostic du traitement COVID-19 (16).Un traitement tardif permet à la population virale du patient d'accumuler une diversité génétique, dont une partie peut être due au stress immunitaire, car le patient présente une faible réponse en anticorps autoneutralisants avant le traitement (16).Après l'administration de REGN-COV2, la fréquence de cinq mutations d'acides aminés dans RBD a changé rapidement (Figure 2C et Figure S4).Notre carte d'échappement a montré que trois de ces mutations ont échappé à REGN10933 et une à REGN10987 (Figure 2B).Il convient de noter qu’après le traitement aux anticorps, toutes les mutations n’ont pas été transférées vers le site fixe.Au contraire, il y a la montée et la chute de la concurrence (figure 2C).Ce schéma a été observé dans l’évolution interne des hôtes adaptatifs d’autres virus (17, 18), probablement en raison de la compétition entre le free-riding génétique et les lignées virales.Ces deux forces semblent jouer un rôle chez les patients présentant une infection persistante (Figure 2C et Figure S4C) : E484A (pas une mutation d'échappement dans notre diagramme) et F486I (évasion REGN10933) en freeride après le traitement, et les lignées virales portant N440D Et Q493K (échappant respectivement à REGN10987 et REGN10933) a d'abord concurrencé le mutant d'évasion REGN10933 Y489H, puis a concouru avec la lignée portant E484A, F486I et Q493K.
Trois des quatre mutations d'échappement chez les patients traités par REGN-COV2 n'ont pas été identifiées lors de la sélection de cultures cellulaires virales de Regeneron (Figure 2B), ce qui illustre l'avantage de la carte complète.La sélection des virus est incomplète car elle ne peut identifier que les mutations sélectionnées au hasard dans cette expérience de culture cellulaire particulière.Au contraire, la carte complète annote toutes les mutations, qui peuvent inclure des mutations provoquées par des raisons non liées au traitement, mais affectant accidentellement la liaison des anticorps.
Bien entendu, l’évolution des virus est affectée par les limitations fonctionnelles et la pression exercée pour échapper aux anticorps.Les mutations et les patients sélectionnés en culture cellulaire répondent toujours aux critères suivants : ils échappent à la liaison des anticorps, peuvent entrer via un seul changement de nucléotide et ont peu ou pas de coût pour l'affinité ACE2 [grâce aux mutations profondes précédentes affichées à l'aide de la mesure par balayage de levure RBD (7 )] (Figure 2D et Figure S5).Par conséquent, une carte complète de la façon dont les mutations affectent les phénotypes biochimiques clés du RBD (tels que la liaison de l’ACE et des anticorps) peut être utilisée pour évaluer les voies possibles d’évolution du virus.Une mise en garde est que sur une période d’évolution plus longue, comme observé dans l’immunité virale et l’évasion médicamenteuse, en raison des interactions épistatiques, l’espace de tolérance aux mutations peut changer (19-21).
La carte complète nous permet d’évaluer les mutations d’évasion existantes dans le SARS-CoV-2 en circulation.Nous avons vérifié toutes les séquences disponibles du SRAS-CoV-2 d’origine humaine au 11 janvier 2021 et avons constaté qu’un grand nombre de mutations RBD échappaient à un ou plusieurs anticorps (Figure 3).Cependant, la seule mutation d'échappement présente dans > 0,1 % de la séquence est le mutant d'évasion REGN10933 Y453F [0,3 % de la séquence ;voir (12)], REGN10987 échappe au mutant N439K [1,7 % de la séquence ;voir Figure 1C et (22)], et LY-CoV016 échappe à la mutation K417N (séquence à 0,1 % ; voir également Figure 1C).Y453F est associé à des foyers indépendants liés à des élevages de visons aux Pays-Bas et au Danemark (23, 24) ;il convient de noter que la séquence de vison elle-même contient parfois d'autres mutations d'échappement, telles que F486L (24).N439K est très populaire en Europe, et constitue une grande partie de la séquence d'Écosse et d'Irlande en Europe (22, 25).K417N existe dans la lignée B.1.351 découverte pour la première fois en Afrique du Sud (10).Une autre mutation actuellement préoccupante est la N501Y, présente dans B.1.351 ainsi que dans la lignée B.1.1.7 initialement identifiée au Royaume-Uni (9).Notre carte montre que N501Y n’a aucun effet sur l’anticorps REGN-COV2, mais seulement un effet modéré sur LY-CoV016 (Figure 3).
Pour chaque anticorps ou combinaison d'anticorps, au 11 janvier 2021, parmi les 317 866 séquences du SRAS-CoV-2 d'origine humaine de haute qualité sur GISAID (26), la relation entre le score d'échappement pour chaque mutation et sa fréquence.C’est marqué.La mutation E406W d’évasion du cocktail REGN-COV2 nécessite de multiples modifications nucléotidiques dans la séquence Wuhan-Hu-1 RBD et n’est pas observée dans la séquence GISAID.D'autres mutations du résidu E406 (E406Q et E406D) ont été observées avec un comptage à basse fréquence, mais ces acides aminés mutants ne sont pas des mutations mononucléotidiques très éloignées de W.
Comme prévu, les mutations d’échappement se produisent généralement dans l’interface anticorps-RBD.Cependant, la structure seule ne suffit pas à prédire quelles mutations sont à l’origine de la fuite.Par exemple, LY-CoV016 utilise ses chaînes lourdes et légères pour se lier à un large épitope qui chevauche la surface de liaison ACE2, mais le processus d'échappement implique des mutations dans les résidus RBD dans la région déterminant la complémentarité des chaînes lourdes (Figure 4A et Figure S6, E à G).En revanche, les fuites de REGN10933 et REGN10987 se sont principalement produites au niveau des résidus RBD empilés à l’interface des chaînes lourdes et légères d’anticorps (Figure 4A et Figure S6, A à D).La mutation E406W qui a échappé au mélange REGN-COV2 s'est produite au niveau de résidus qui n'étaient en contact avec aucun des deux anticorps (Figure 4, A et B).Bien que E406 soit structurellement plus proche de LY-CoV016 (Figure 4B et Figure S6H), la mutation E406W a un effet beaucoup plus faible sur l'anticorps (Figure 1, B et C), ce qui indique que le mécanisme structurel spécifique à longue portée est anti-REGN. - Anticorps COV2 (Figure S6I).En résumé, les mutations au niveau des résidus RBD en contact avec les anticorps n'entraînent pas toujours la fuite, et certaines mutations d'évasion significatives se produisent au niveau des résidus non en contact avec les anticorps (Figure 4B et Figure S6, D et G).
(A) Le diagramme d’échappement projeté sur la structure RBD liée par l’anticorps.[REGN10933 et REGN10987 : base de données sur les protéines (PDB) ID 6XDG (11) ;LY-CoV016 : ID PDB 7C01 (13)].Les domaines variables des chaînes lourdes et légères de l'anticorps sont représentés par des dessins bleus, et la couleur à la surface du RBD indique la force de la fuite médiée par la mutation sur ce site (le blanc indique l'absence de fuite et le rouge indique la plus forte fuite). site d'échappement de l'anticorps ou du mélange) .Les sites qui ne sont pas fonctionnellement mutés sont grisés.(B) Pour chaque anticorps, classez le site comme contact direct avec l’anticorps (atomes non hydrogène à moins de 4 Å de l’anticorps), anticorps proximal (4 à 8 Å) ou anticorps distal (> 8 Å).Chaque point représente un site, divisé en évasion (rouge) ou non-évasion (noir).La ligne pointillée grise représente la valeur critique utilisée pour classer le site comme évasion ou non-évasion (pour plus de détails, voir Matériels et méthodes).Les nombres rouges et noirs indiquent combien de sites dans chaque catégorie sont échappés ou non.
Dans cette étude, nous avons complètement cartographié les mutations qui échappent aux trois principaux anticorps anti-SARS-CoV-2.Ces cartes indiquent que la caractérisation précédente des mutations d'échappement est incomplète.Ni les mutations d’un seul acide aminé pouvant échapper aux deux anticorps du cocktail REGN-COV2 n’ont été identifiées, ni la majorité des patients infectés persistants traités avec le cocktail.mutation.Bien entendu, notre carte n’a pas encore répondu à la question la plus pressante : le SRAS-CoV-2 développera-t-il une résistance étendue à ces anticorps ?Mais ce qui est certain, c’est qu’il est inquiétant que tant de mutations d’échappement aient peu d’effet sur le repliement du RBD ou l’affinité des récepteurs, et qu’il existe déjà des mutations de faible niveau dans les virus en circulation.En fin de compte, il faut attendre et observer quelles mutations le SARS-CoV-2 transmettra lorsqu’il se propagera dans la population.Nos travaux contribueront à « l’observation » en expliquant immédiatement l’impact des mutations classées par la surveillance du génome viral.
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Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
La carte complète des mutations du SRAS-CoV-2 qui échappent au mélange d’anticorps monoclonaux Regeneron permet d’expliquer l’évolution du virus lors du traitement des patients.
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La carte complète des mutations du SRAS-CoV-2 qui échappent au mélange d’anticorps monoclonaux Regeneron permet d’expliquer l’évolution du virus lors du traitement des patients.
©2021 Association américaine pour l'avancement de la science.tous droits réservés.AAAS est partenaire de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef et COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Heure de publication : 24 février 2021