Varios anticorpos xa están en uso ou en desenvolvemento como terapias para o tratamento da COVID-19.Coa aparición de novas variantes do coronavirus 2 da síndrome respiratoria aguda grave (SARS-CoV-2), é importante prever se aínda serán susceptibles á terapia con anticorpos.Starr et al.Utilizouse unha biblioteca de lévedos, que abarca todas as mutacións no dominio de unión ao receptor SARS-CoV-2 que non perturbarán fortemente a unión ao receptor do hóspede (ACE2), e mapea como estas mutacións afectan os tres principais anti-SARS-CoV. -2 Unión de anticorpos.Estas cifras identifican mutacións que escapan á unión de anticorpos, incluídas mutacións únicas que escapan dos dous anticorpos na mestura de anticorpos Regeneron.Moitas mutacións que escapan dun só anticorpo están a estenderse nos humanos.
Os anticorpos son unha terapia potencial para o tratamento da síndrome respiratoria aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), pero non está claro que o virus se desenvolva para escapar do seu risco.Aquí, mapeamos como todas as mutacións no dominio de unión ao receptor SARS-CoV-2 (RBD) afectan á unión do cóctel REGN-COV2 ao anticorpo LY-CoV016.Estes mapas completos revelaron unha mutación de aminoácidos que evadía por completo a mestura REGN-COV2, que está composta por dous anticorpos REGN10933 e REGN10987 que teñen como obxectivo diferentes epítopos estruturais.Estas cifras tamén identifican mutacións de virus seleccionadas en pacientes persistentes infectados tratados con REGN-COV2 e durante a selección de escape de virus in vitro.Finalmente, estas cifras revelan que as mutacións que escapan dun só anticorpo xa están presentes nas cepas circulantes de SARS-CoV-2.Estes mapas de escape completos poden explicar as consecuencias das mutacións observadas durante a vixilancia do virus.
Están a desenvolverse anticorpos para tratar a síndrome respiratoria aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (1).Os anticorpos contra outros virus poden resultar ineficaces por mutacións de virus seleccionadas durante o tratamento de pacientes infectados (2, 3) ou mutacións virais que se espallaron globalmente para conferir resistencia a todo o clado do virus.Polo tanto, determinar que mutacións do SARS-CoV-2 poden escapar dos anticorpos clave é fundamental para avaliar como as mutacións observadas durante a vixilancia do virus afectan a eficacia da terapia con anticorpos.
A maioría dos principais anticorpos anti-SARS-CoV-2 teñen como obxectivo o dominio de unión ao receptor viral (RBD), que media a unión ao receptor da enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) (5, 6).Recentemente, desenvolvemos un método de exploración de mutacións profundas para mapear como todas as mutacións de RBD afectan a súa función e o recoñecemento dos anticorpos antivirais (7, 8).O método consiste na creación dunha biblioteca de mutantes de RBD, expresándoos na superficie do lévedo e usando a clasificación celular activada por fluorescencia e a secuenciación profunda para cuantificar como cada mutación afecta o pregamento de RBD, a afinidade ACE2 (medida nunha serie de titulación) e a unión de anticorpos. (Figura S1A).Neste estudo, usamos a biblioteca de mutantes repetitivos descrita en (7), que está composta por variantes RBD con código de barras, que abarca 3804 das 3819 posibles mutacións de aminoácidos.A nosa biblioteca preparouse a partir do fondo xenético RBD do illado temperán Wuhan-Hu-1.Aínda que a frecuencia de varios mutantes está aumentando, aínda representan as secuencias RBD máis comúns (9, 10).Debuxamos dúas das 2034 mutacións que non interrompen fortemente o pregamento RBD e a unión ACE (7) como pasar o cóctel REGN-COV2 (REGN10933 e REGN10987) (11, 12) e LY-CoV016 de Eli Lilly A forma recombinante do anticorpo afecta o método de unión de anticorpos (tamén chamado CB6 ou JS016) (13) (Figura S1B).O REGN-COV2 recibiu recentemente unha autorización de uso de emerxencia para COVID-19 (14), mentres que LY-CoV016 está en fase de ensaios clínicos de fase 3 (15).
[Glu406→Trp(E406W)] escapou fortemente da mestura de dous anticorpos (Figura 1A).O mapa de escape de LY-CoV016 tamén revelou moitas mutacións de escape en diferentes sitios en RBD (Figura 1B).Aínda que algunhas mutacións de escape poden prexudicar a capacidade de RBD para unirse a ACE2 ou expresarse nunha forma adecuadamente pregada, segundo medicións previas de exploración de mutacións profundas usando RBD mostrado por lévedos, moitas mutacións funcionais teñen pouco ou ningún efecto sobre estas propiedades funcionais (7). ) (As figuras 1, A e B representan a perda da afinidade ACE2, mentres que a figura S2 representa a diminución da expresión de RBD.
(A) Mapeo do anticorpo en REGN-COV2.O gráfico de liñas da esquerda mostra a fuga en cada sitio no RBD (a suma de todas as mutacións en cada sitio).A imaxe do logotipo da dereita mostra o lugar de escape forte (subliñado morado).A altura de cada letra é proporcional á forza da fuga mediada pola mutación do aminoácido, e unha "puntuación de escape" de 1 para cada mutación corresponde a unha fuga completa.A escala do eixe y é diferente para cada fila, polo que, por exemplo, E406W escapa de todos os anticorpos REGN, pero é máis obvio para os cócteles porque está desbordado polos outros sitios de escape dos anticorpos individuais.Para a versión escalable, S2, A e B utilízanse para colorear o mapa segundo como afectan as mutacións á expresión do RBD dobrado.S2, C e D utilízanse para distribuír a influencia sobre a afinidade de ACE2 e a expresión de RBD entre todas as mutacións observadas nos illados de virus circulantes.(B) Como se mostra en (A), debuxa LY-CoV016.(C) Use partículas lentivirais pseudotipadas con espiga para verificar as mutacións clave no ensaio de neutralización.Optamos por verificar as mutacións que se prevé que teñan un maior impacto ou que existan con alta frecuencia en illados de SARS-CoV-2 (como N439K) na circulación.Cada punto representa o aumento de veces da concentración inhibitoria media (IC50) da mutación en relación ao pico do tipo salvaxe non mutado (WT) que contén D614G.A liña discontinua azul 1 representa un efecto de neutralización similar ao WT, e un valor > 1 representa un aumento da resistencia á neutralización.A cor do punto indica se queres escapar do mapa.Os puntos indican que, dado que o IC50 está fóra da serie de dilución utilizada, compróbase o cambio múltiple (límite superior ou inferior).A maioría dos mutantes son probados por duplicado, polo que hai dous puntos.A curva de neutralización completa móstrase na Figura 2. S3.As abreviaturas dunha letra dos residuos de aminoácidos son as seguintes: A, Ala;C, cisteína;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, seu;eu, Ile;K, lisina;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptófano;e Y, Tyr.
Para verificar o efecto antixénico das mutacións clave, realizamos un ensaio de neutralización utilizando partículas lentivirais pseudotipadas en panículas e descubrimos que había unha coherencia entre o mapa de escape de unión de anticorpos e o ensaio de neutralización (Figura 1C e Figura S3).Como era de esperar do mapa de anticorpos REGN-COV2, a mutación da posición 486 só é neutralizada por REGN10933, mentres que a mutación das posicións 439 e 444 só é neutralizada por REGN10987, polo que estas mutacións non poden escapar.Pero E406W escapou dos dous anticorpos REGN-COV2, polo que tamén escapou fortemente da mestura.A través da análise estrutural e da selección de escape de virus, Regeneron cre que ningunha mutación de aminoácido pode escapar dos dous anticorpos do cóctel (11, 12), pero o noso mapa completo identifica a E406W como unha mutación de escape de cóctel.E406W afecta o anticorpo REGN-COV2 dunha forma relativamente específica e non interfire seriamente coa función de RBD, porque só reduce lixeiramente o efecto de neutralización de LY-CoV016 (Figura 1C) e o título de partículas lentivirais pseudotipadas con picos (Figura 1). S3F).
Co fin de explorar se o noso mapa de escape é consistente coa evolución dos virus baixo a selección de anticorpos, comprobamos primeiro os datos do experimento de selección de escape do virus Regeneron, no que o pico de expresión foi cultivado en cultivo celular en presenza de calquera REGN10933 O vesicular. virus da estomatite (VSV), REGN10987 ou cóctel REGN-COV2 (12).Este traballo identificou cinco mutacións de escape de REGN10933, dúas mutacións de escape de REGN10987 e ningunha mutación de cóctel (Figura 2A).As mutacións seleccionadas polos sete cultivos celulares están destacadas no noso mapa de escape, e o cambio dun só nucleótido do codón de tipo salvaxe na secuencia Wuhan-Hu-1 RBD tamén é accesible (Figura 2B), o que indica a diferenza entre os escapes. gráfico e evolución do virus baixo presión de anticorpos en cultivo celular.Paga a pena sinalar que non se pode acceder a E406W mediante cambios de nucleótidos únicos, o que pode explicar por que a selección de cócteles Regeneron non pode identificalo a pesar da tolerancia relativamente boa do pregamento RBD e da afinidade ACE2.
(A) En presenza de anticorpos, Regeneron usa o pseudotipo de panícula VSV para seleccionar mutacións de escape do virus no cultivo celular (12).(B) O diagrama de escape, como se mostra na Figura 1A, pero só mostra as mutacións accesibles por un único cambio de nucleótido na secuencia Wuhan-Hu-1.O non gris indica mutacións no cultivo celular (vermello) e pacientes infectados (azul) ), ou ambos (violeta).A figura S5 mostra estes gráficos, que están coloreados por como as mutacións afectan á afinidade de ACE2 ou á expresión RBD.(C) Cinética da mutación RBD en pacientes tratados con REGN-COV2 o día 145 da infección (liña vertical de puntos negros).A frecuencia de enlace entre E484A e F486I aumentou, pero como E484A non é unha mutación de escape na nosa figura, non se mostra noutros paneis.Ver tamén figura.S4.(D) As mutacións de escape que ocorren en cultivos celulares e pacientes infectados son accesibles por un só nucleótido, e a unión de anticorpos de escape non causa ningún custo importante para a afinidade ACE2 [medido polo método de visualización de lévedos (7)].Cada punto é unha mutación, e a súa forma e cor indican se se pode acceder e seleccionar durante o crecemento do virus.Cantos máis puntos da dereita no eixe x indican un escape de unión de anticorpos máis forte;os puntos máis altos do eixe y indican maior afinidade ACE2.
Para determinar se Escape Atlas pode analizar a evolución dos virus que infectan a humanos, examinamos os datos de secuenciación profunda dun paciente inmunocomprometido con infección persistente que recibiu REGN-COV2 o día 145 despois do diagnóstico do tratamento COVID-19 (16).O tratamento tardío permite que a poboación viral do paciente acumule diversidade xenética, algunhas das cales poden estar impulsadas polo estrés inmune, porque o paciente ten unha resposta de anticorpos autoneutralizador débil antes do tratamento (16).Despois da administración de REGN-COV2, a frecuencia de cinco mutacións de aminoácidos en RBD cambiou rapidamente (Figura 2C e Figura S4).O noso mapa de escape mostrou que tres destas mutacións escaparon de REGN10933 e unha de REGN10987 (Figura 2B).Paga a pena notar que despois do tratamento con anticorpos, non todas as mutacións foron transferidas ao sitio fixo.Pola contra, prodúcese o ascenso e a caída da competencia (Figura 2C).Este patrón observouse na evolución interna dos hóspedes adaptativos doutros virus (17, 18), posiblemente debido á competencia entre os xenéticos free-riding e as liñaxes virais.Ambas estas forzas parecen desempeñar un papel en pacientes con infección persistente (Figura 2C e Figura S4C): E484A (non é unha mutación de escape no noso diagrama) e F486I (escape REGN10933) que conducen libremente despois do tratamento e as liñaxes de virus que levan N440D e Q493K (escapando de REGN10987 e REGN10933, respectivamente) competiu primeiro co mutante de fuga REGN10933 Y489H, e despois competiu coa liñaxe que levaba E484A e F486I e Q493K.
Tres das catro mutacións de escape en pacientes tratados con REGN-COV2 non foron identificadas na selección do cultivo celular do virus de Regeneron (Figura 2B), o que ilustra a vantaxe do mapa completo.A selección de virus é incompleta porque só poden identificar as mutacións seleccionadas aleatoriamente nese experimento de cultivo celular en particular.Pola contra, o mapa completo anota todas as mutacións, que poden incluír mutacións causadas por motivos alleos ao tratamento, pero que accidentalmente afectan á unión de anticorpos.
Por suposto, a evolución dos virus vese afectada polas limitacións funcionais e a presión para evadir os anticorpos.As mutacións e os pacientes seleccionados en cultivo celular sempre cumpren os seguintes criterios: escapan da unión de anticorpos, poden entrar a través dun único cambio de nucleótido e teñen pouco ou ningún custo para a afinidade ACE2 [a través das mutacións profundas anteriores mostradas mediante a medición de exploración RBD de levadura (7). )] (Figura 2D e Figura S5).Polo tanto, pódese utilizar un mapa completo de como as mutacións afectan os fenotipos bioquímicos clave de RBD (como a unión de ACE e anticorpos) para avaliar posibles vías de evolución do virus.Unha advertencia é que nun período de tempo evolutivo máis longo, como se observa na inmunidade viral e na fuga de fármacos, debido ás interaccións epistáticas, o espazo de tolerancia ás mutacións pode cambiar (19-21).
O mapa completo permítenos avaliar as mutacións de fuga existentes no SARS-CoV-2 circulante.Comprobamos todas as secuencias dispoñibles de SARS-CoV-2 derivadas de humanos a partir do 11 de xaneiro de 2021 e descubrimos que un gran número de mutacións RBD escapaban dun ou máis anticorpos (figura 3).Porén, a única mutación de escape presente en >0,1% da secuencia é o mutante de escape Y453F REGN10933 [0,3% da secuencia;ver (12)], REGN10987 escape mutante N439K [1,7% da secuencia;ver Figura 1C e (22)], e LY-CoV016 escapa da mutación K417N (secuencia do 0,1%; vexa tamén a Figura 1C).Y453F está asociado con brotes independentes relacionados con granxas de visóns nos Países Baixos e Dinamarca (23, 24);cómpre sinalar que a propia secuencia do visón ás veces contén outras mutacións de escape, como F486L (24).N439K é moi popular en Europa e constitúe unha gran parte da secuencia de Escocia e Irlanda en Europa (22, 25).K417N existe na liñaxe B.1.351 descuberta por primeira vez en Sudáfrica (10).Outra mutación de preocupación actual é a N501Y, que está presente en B.1.351 e tamén na liñaxe B.1.1.7 identificada orixinalmente no Reino Unido (9).O noso mapa mostra que N501Y non ten ningún efecto sobre o anticorpo REGN-COV2, pero só un efecto moderado sobre LY-CoV016 (figura 3).
Para cada anticorpo ou combinación de anticorpos, a partir do 11 de xaneiro de 2021, entre as 317.866 secuencias SARS-CoV-2 derivadas de humanos de alta calidade en GISAID (26), a relación entre a puntuación de escape de cada mutación e a súa frecuencia .Está marcado.A mutación de fuga do cóctel REGN-COV2 E406W require múltiples cambios de nucleótidos na secuencia Wuhan-Hu-1 RBD e non se observa na secuencia GISAID.Observáronse outras mutacións do residuo E406 (E406Q e E406D) cun reconto de baixa frecuencia, pero estes aminoácidos mutantes non son mutacións dun só nucleótido lonxe de W.
Como era de esperar, as mutacións de escape adoitan ocorrer na interface anticorpo-RBD.Non obstante, a estrutura por si soa non é suficiente para predicir que mutacións median a fuga.Por exemplo, LY-CoV016 usa as súas cadeas pesadas e lixeiras para unirse a un epítopo amplo que se solapa coa superficie de unión ACE2, pero o proceso de escape implica mutacións nos residuos de RBD na rexión que determina a complementariedade da cadea pesada (Figura 4A e Figura S6, E a G).Pola contra, as fugas de REGN10933 e REGN10987 producíronse principalmente nos residuos de RBD apilados na interface das cadeas pesadas e lixeiras de anticorpos (Figura 4A e Figura S6, A a D).A mutación E406W que escapou da mestura REGN-COV2 produciuse en residuos que non estaban en contacto con ningún dos anticorpos (Figura 4, A e B).Aínda que E406 está estruturalmente máis próximo a LY-CoV016 (Figura 4B e Figura S6H), a mutación E406W ten un efecto moito menor sobre o anticorpo (Figura 1, B e C), o que indica que o mecanismo estrutural específico de longo alcance é anti-REGN. - Anticorpo COV2 (Figura S6I).En resumo, as mutacións nos residuos de RBD en contacto con anticorpos non sempre median na fuga, e algunhas mutacións de escape significativas ocorren en residuos que non están en contacto con anticorpos (figura 4B e figura S6, D e G).
(A) O diagrama de escape proxectado na estrutura RBD unida polo anticorpo.[REGN10933 e REGN10987: ID de base de datos de proteínas (PDB) 6XDG (11);LY-CoV016: ID PDB 7C01 (13)].Os dominios variables das cadeas pesadas e lixeiras do anticorpo móstranse como debuxos animados azuis, e a cor da superficie do RBD indica a forza da fuga mediada pola mutación neste sitio (o branco indica que non hai escape e o vermello indica o máis forte). lugar de escape do anticorpo ou da mestura).Os sitios que non están funcionalmente mutados aparecen en gris.(B) Para cada anticorpo, clasifica o sitio como contacto directo de anticorpos (átomos non de hidróxeno dentro de 4Å do anticorpo), anticorpo proximal (4 a 8Å) ou anticorpo distal (> 8Å).Cada punto representa un sitio, dividido en escape (vermello) ou non escape (negro).A liña discontinua gris representa o valor crítico usado para clasificar o sitio como escape ou non escape (para máis detalles, consulte Materiais e métodos).Os números vermellos e negros indican cantos sitios de cada categoría están escapados ou sen escapar.
Neste estudo, cartografiamos completamente as mutacións que evaden os tres principais anticorpos anti-SARS-CoV-2.Estes mapas indican que a caracterización previa das mutacións de escape é incompleta.Non se identificaron mutacións de aminoácidos únicos que poidan escapar dos dous anticorpos do cóctel REGN-COV2, nin identificaron á maioría dos pacientes con infección persistente tratados co cóctel.mutación.Por suposto, o noso mapa aínda non respondeu á pregunta máis urxente: desenvolverá o SARS-CoV-2 unha gran resistencia a estes anticorpos?Pero o certo é que é preocupante que tantas mutacións de escape teñan pouco efecto sobre o pregamento RBD ou a afinidade dos receptores, e xa hai algunhas mutacións de baixo nivel nos virus circulantes.Ao final, hai que esperar e observar que mutacións transmitirá o SARS-CoV-2 cando se propague entre a poboación.O noso traballo axudará á "observación" explicando inmediatamente o impacto das mutacións clasificadas pola vixilancia do xenoma viral.
Este é un artigo de acceso aberto distribuído baixo os termos da licenza Creative Commons Attribution.O artigo permite o uso, distribución e reprodución sen restricións en calquera soporte, a condición de que a obra orixinal estea debidamente citada.
Nota: só che pedimos que proporciones o teu enderezo de correo electrónico para que a persoa que recomendas á páxina saiba que queres que vexa o correo electrónico e que non é spam.Non capturaremos ningún enderezo de correo electrónico.
Esta pregunta úsase para comprobar se es un visitante e evitar o envío automático de spam.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
O mapa completo das mutacións SARS-CoV-2 que escapan da mestura de anticorpos monoclonais Regeneron axuda a explicar a evolución do virus no tratamento dos pacientes.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
O mapa completo das mutacións SARS-CoV-2 que escapan da mestura de anticorpos monoclonais Regeneron axuda a explicar a evolución do virus no tratamento dos pacientes.
©2021 Asociación Americana para o Avance da Ciencia.todos os dereitos reservados.AAAS é socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Hora de publicación: 24-feb-2021