Nekoliko antitijela već se koristi ili su u razvoju kao terapije za liječenje COVID-19.S pojavom novih varijanti teškog akutnog respiratornog sindroma coronavirus 2 (SARS-CoV-2), važno je predvidjeti hoće li i dalje biti osjetljivi na terapiju antitijelima.Starr i sur.Upotrijebljena je biblioteka kvasca koja pokriva sve mutacije u domeni vezanja receptora SARS-CoV-2 koje neće snažno poremetiti vezanje za receptor domaćina (ACE2) i mapirati kako te mutacije utječu na tri glavna anti-SARS-CoV -2 vezanje antitijela.Ove brojke identificiraju mutacije koje izbjegavaju vezanje antitijela, uključujući pojedinačne mutacije koje izbjegavaju dva antitijela u mješavini antitijela Regeneron.Mnoge mutacije koje izmaknu jednom antitijelu šire se u ljudima.
Protutijela su potencijalna terapija za liječenje teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirusa 2 (SARS-CoV-2), ali nije jasno da se virus razvija kako bi izbjegao njihov rizik.Ovdje mapiramo kako sve mutacije u domeni vezanja receptora SARS-CoV-2 (RBD) utječu na vezanje koktela REGN-COV2 na antitijelo LY-CoV016.Ove potpune karte otkrile su mutaciju aminokiselina koja je potpuno izbjegla mješavinu REGN-COV2, koja se sastoji od dva antitijela REGN10933 i REGN10987 koja ciljaju različite strukturne epitope.Ove brojke također identificiraju mutacije virusa odabrane kod trajno zaraženih pacijenata liječenih REGN-COV2 i tijekom in vitro selekcije virusa koji bi pobjegao.Konačno, ove brojke otkrivaju da su mutacije koje izmiču jednom antitijelu već prisutne u cirkulirajućim sojevima SARS-CoV-2.Ove potpune karte bijega mogu objasniti posljedice mutacija uočenih tijekom nadzora virusa.
Antitijela se razvijaju za liječenje teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirusa 2 (SARS-CoV-2) (1).Protutijela protiv nekih drugih virusa mogu postati neučinkovita zbog mutacija virusa odabranih tijekom liječenja zaraženih pacijenata (2, 3) ili mutacija virusa koje su se proširile globalno da bi dale otpornost cijelom klasu virusa.Stoga je određivanje koje SARS-CoV-2 mutacije mogu izbjeći ključna antitijela ključno za procjenu kako mutacije uočene tijekom nadzora virusa utječu na učinkovitost terapije antitijelima.
Većina vodećih anti-SARS-CoV-2 antitijela cilja na virusnu receptorsku veznu domenu (RBD), koja posreduje u vezivanju na receptor angiotenzin konvertirajućeg enzima 2 (ACE2) (5, 6).Nedavno smo razvili metodu dubokog skeniranja mutacija kako bismo mapirali kako sve mutacije RBD-a utječu na njegovu funkciju i prepoznavanje od strane antivirusnih protutijela (7, 8).Metoda uključuje stvaranje biblioteke mutanata RBD-a, njihovu ekspresiju na površini kvasca i korištenje razvrstavanja stanica aktiviranog fluorescencijom i dubokog sekvenciranja kako bi se kvantificiralo kako svaka mutacija utječe na savijanje RBD-a, afinitet ACE2 (mjeren u nizu titracija) i vezanje protutijela (Slika S1A).U ovoj studiji upotrijebili smo biblioteku ponavljajućih mutanata opisanu u (7), koja se sastoji od RBD varijanti s barkodom, pokrivajući 3804 od 3819 mogućih mutacija aminokiselina.Naša je biblioteka pripremljena iz RBD genetske pozadine ranog izolata Wuhan-Hu-1.Iako je učestalost nekoliko mutanata u porastu, oni još uvijek predstavljaju najčešće RBD sekvence (9, 10).Nacrtali smo dvije od 2034 mutacije koje ne ometaju presavijanje RBD-a i vezanje ACE (7) kako prenijeti REGN-COV2 koktel (REGN10933 i REGN10987) (11, 12) i Eli Lillyjev LY-CoV016 Rekombinantni oblik antitijelo utječe na metodu vezanja antitijela (također nazvano CB6 ili JS016) (13) (Slika S1B).REGN-COV2 nedavno je dobio odobrenje za hitnu upotrebu za COVID-19 (14), dok je LY-CoV016 trenutno u fazi 3 kliničkih ispitivanja (15).
[Glu406→Trp(E406W)] snažno je izbjegao mješavinu dvaju protutijela (Slika 1A).Karta bijega LY-CoV016 također je otkrila mnoge mutacije bijega na različitim mjestima u RBD-u (Slika 1B).Iako neke izlazne mutacije mogu oslabiti sposobnost RBD-a da se veže za ACE2 ili ekspresira u prikladno savijenom obliku, prema prethodnim mjerenjima skeniranja dubokih mutacija korištenjem RBD-a prikazanog kvascem, mnoge funkcionalne mutacije imaju mali ili nikakav učinak na ova funkcionalna svojstva (7 ) (Slika 1, A i B predstavljaju gubitak afiniteta ACE2, dok slika S2 predstavlja smanjenje ekspresije RBD-a.
(A) Mapiranje antitijela u REGN-COV2.Linijski grafikon s lijeve strane prikazuje izlaz na svakom mjestu u RBD (zbroj svih mutacija na svakom mjestu).Slika logotipa na desnoj strani prikazuje jaku lokaciju za bijeg (ljubičasto podvučeno).Visina svakog slova proporcionalna je snazi bijega posredovanog mutacijom aminokiseline, a "ocjena bijega" od 1 za svaku mutaciju odgovara potpunom bijegu.Ljestvica na osi y je drugačija za svaki red, tako da, na primjer, E406W izbjegava sva REGN antitijela, ali to je najočiglednije za koktele jer je preplavljeno drugim mjestima izlaza pojedinačnih antitijela.Za skalabilnu verziju, S2, A i B, koriste se za bojenje karte prema tome kako mutacije utječu na ekspresiju presavijenog RBD-a.S2, C i D koriste se za raspodjelu utjecaja na afinitet ACE2 i ekspresiju RBD među svim mutacijama uočenim u cirkulirajućim izolatima virusa.(B) Kao što je prikazano u (A), nacrtajte LY-CoV016.(C) Upotrijebite pseudotipizirane lentivirusne čestice za provjeru ključnih mutacija u testu neutralizacije.Odlučili smo provjeriti mutacije za koje se predviđa da imaju veći utjecaj ili da postoje s visokom učestalošću u izolatima SARS-CoV-2 (kao što je N439K) u cirkulaciji.Svaka točka predstavlja višestruko povećanje srednje inhibicijske koncentracije (IC50) mutacije u odnosu na vrhunac nemutiranog divljeg tipa (WT) koji sadrži D614G.Plava isprekidana linija 1 predstavlja učinak neutralizacije sličan WT, a vrijednost> 1 predstavlja povećanu otpornost neutralizacije.Boja točke označava želite li pobjeći s karte.Točke označavaju da se provjerava višestruka promjena (gornja ili donja granica), budući da je IC50 izvan korištene serije razrjeđenja.Većina mutanata se testira u duplikatu, tako da postoje dvije točke.Potpuna krivulja neutralizacije prikazana je na slici 2. S3.Jednoslovne kratice aminokiselinskih ostataka su sljedeće: A, Ala;C, cistein;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, njegov;ja, Ile;K, lizin;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptofan;i Y, Tyr.
Kako bismo provjerili antigenski učinak ključnih mutacija, proveli smo neutralizacijski test koristeći pseudotipizirane lentivirusne čestice metlice i otkrili da postoji dosljednost između karte izbjegavanja vezanja antitijela i neutralizacijskog testa (Slika 1C i Slika S3).Kao što se i očekivalo od karte antitijela REGN-COV2, mutacija na poziciji 486 neutralizirana je samo REGN10933, dok je mutacija na pozicijama 439 i 444 neutralizirana samo REGN10987, tako da te mutacije ne mogu pobjeći.Ali E406W je izbjegao dva REGN-COV2 antitijela, tako da je također snažno pobjegao iz mješavine.Strukturalnom analizom i izborom za izbjegavanje virusa, Regeneron vjeruje da niti jedna aminokiselinska mutacija ne može izbjeći dva antitijela u koktelu (11, 12), ali naša potpuna karta identificira E406W kao mutaciju za izbjegavanje koktela.E406W djeluje na REGN-COV2 protutijelo na relativno specifičan način i ne ometa ozbiljno funkciju RBD-a, jer samo malo smanjuje učinak neutralizacije LY-CoV016 (Slika 1C) i titar pseudotipiziranih lentivirusnih čestica ( Slika S3F).
Kako bismo istražili je li naša karta bijega u skladu s evolucijom virusa pod selekcijom antitijela, prvo smo provjerili podatke eksperimenta selekcije bijega virusa Regeneron, u kojem je ekspresijski šiljak uzgajan u staničnoj kulturi u prisutnosti bilo kojeg REGN10933 vezikularnog virus stomatitisa (VSV), koktel REGN10987 ili REGN-COV2 (12).Ovaj je rad identificirao pet escape mutacija iz REGN10933, dvije escape mutacije iz REGN10987 i nijednu mutaciju iz koktela (Slika 2A).Mutacije koje je odabralo svih sedam staničnih kultura istaknute su u našoj escape mapi, a jednonukleotidna promjena kodona divljeg tipa u Wuhan-Hu-1 RBD sekvenci također je dostupna (slika 2B), što ukazuje na razliku između escape-a. graf i evolucija virusa pod pritiskom antitijela u staničnoj kulturi.Vrijedno je napomenuti da se E406W ne može pristupiti promjenama jednog nukleotida, što može objasniti zašto ga Regeneron koktel odabir ne može identificirati unatoč relativno dobroj toleranciji RBD presavijanja i afiniteta ACE2.
(A) U prisutnosti protutijela, Regeneron koristi pseudotip VSV metlice za selekciju mutacija koje su pobjegle od virusa u staničnoj kulturi (12).(B) Dijagram izlaza, kao što je prikazano na slici 1A, ali prikazuje samo mutacije dostupne promjenom jednog nukleotida u sekvenci Wuhan-Hu-1.Nesivo označava mutacije u staničnoj kulturi (crveno) i zaražene pacijente (plavo)), ili oboje (ljubičasto).Slika S5 prikazuje ove grafikone, koji su obojeni prema tome kako mutacije utječu na afinitet ACE2 ili ekspresiju RBD-a.(C) Kinetika RBD mutacije u bolesnika liječenih REGN-COV2 145. dana infekcije (crna točkasta okomita linija).Učestalost povezivanja između E484A i F486I se povećala, ali budući da E484A nije izlazna mutacija na našoj slici, nije prikazana na drugim pločama.Vidi također sliku.S4.(D) Escape mutacije koje se javljaju u staničnoj kulturi i zaraženim pacijentima dostupne su pomoću jednog nukleotida, a vezanje escape antitijela ne uzrokuje velike troškove za afinitet ACE2 [kako je izmjereno metodom prikaza kvasca (7)].Svaka točka je mutacija, a njezin oblik i boja pokazuju može li joj se pristupiti i odabrati tijekom rasta virusa.Više desnih točaka na x-osi ukazuje na jače izbjegavanje vezanja antitijela;više točke na y-osi ukazuju na viši afinitet ACE2.
Kako bismo utvrdili može li Escape Atlas analizirati evoluciju virusa koji zaraze ljude, ispitali smo podatke dubokog sekvenciranja trajno zaraženog pacijenta s oslabljenim imunitetom koji je primio REGN-COV2 145. dana nakon dijagnoze liječenja COVID-19 (16).Kasno liječenje omogućuje pacijentovoj virusnoj populaciji akumulaciju genetske raznolikosti, od kojih neke mogu biti potaknute imunološkim stresom, jer pacijent ima slab odgovor autoneutralizirajućih protutijela prije liječenja (16).Nakon primjene REGN-COV2, učestalost pet mutacija aminokiselina u RBD-u brzo se promijenila (Slika 2C i Slika S4).Naša karta bijega pokazala je da su tri od ovih mutacija pobjegle REGN10933, a jedna REGN10987 (Slika 2B).Vrijedno je napomenuti da nakon tretmana antitijelima nisu sve mutacije prenesene na fiksno mjesto.Naprotiv, postoji uspon i pad konkurencije (Slika 2C).Ovaj je obrazac uočen u unutarnjoj evoluciji adaptivnih domaćina drugih virusa (17, 18), vjerojatno zbog natjecanja između genetskih slobodnih i virusnih linija.Čini se da obje ove sile igraju ulogu kod pacijenata s perzistentnom infekcijom (Slika 2C i Slika S4C): E484A (nije izlazna mutacija u našem dijagramu) i F486I (bježajuća REGN10933) slobodno se kreću nakon liječenja, i virusne linije koje nose N440D I Q493K (koji je izbjegao REGN10987 odnosno REGN10933) prvo se natjecao s REGN10933 odbjeglim mutantom Y489H, a zatim se natjecao s linijom koja nosi E484A i F486I i Q493K.
Tri od četiri izlazne mutacije kod pacijenata liječenih s REGN-COV2 nisu identificirane u selekciji stanične kulture Regenerona virusa (Slika 2B), što ilustrira prednost potpune karte.Odabir virusa je nepotpun jer oni mogu identificirati samo sve mutacije nasumično odabrane u tom određenom eksperimentu stanične kulture.Naprotiv, kompletna mapa označava sve mutacije, koje mogu uključivati mutacije uzrokovane razlozima koji nisu povezani s liječenjem, ali slučajno utječu na vezanje protutijela.
Naravno, na evoluciju virusa utječu funkcionalna ograničenja i pritisak da se izbjegnu antitijela.Mutacije i pacijenti odabrani u staničnoj kulturi uvijek ispunjavaju sljedeće kriterije: izbjegavaju vezanje protutijela, mogu ući kroz jednu promjenu nukleotida i imaju malo ili nimalo troškova za afinitet ACE2 [kroz prethodne duboke mutacije prikazane pomoću mjerenja skeniranja kvasca RBD (7 )] (Slika 2D i Slika S5).Stoga se potpuna karta o tome kako mutacije utječu na ključne biokemijske fenotipove RBD-a (kao što su ACE i vezanje protutijela) može se koristiti za procjenu mogućih putova za evoluciju virusa.Jedno upozorenje je da se u dužem evolucijskom vremenskom okviru, kao što je uočeno kod virusnog imuniteta i izbjegavanja lijekova, zbog epistatičkih interakcija, prostor tolerancije za mutacije može promijeniti (19-21).
Potpuna karta omogućuje nam procjenu postojećih mutacija za bijeg u cirkulirajućem SARS-CoV-2.Provjerili smo sve dostupne sekvence SARS-CoV-2 izvedene od ljudi od 11. siječnja 2021. i otkrili da je veliki broj mutacija RBD-a izbjegao jedno ili više protutijela (Slika 3).Međutim, jedina escape mutacija prisutna u >0,1% sekvence je REGN10933 escape mutant Y453F [0,3% sekvence;vidi (12)], REGN10987 escape mutant N439K [1,7% sekvence;vidi sliku 1C i (22)], i LY-CoV016 izlazna mutacija K417N (0,1% sekvenca; vidi također sliku 1C).Y453F je povezan s neovisnim izbijanjima povezanih s farmama nerca u Nizozemskoj i Danskoj (23, 24);vrijedno je napomenuti da sama sekvenca mink ponekad sadrži druge escape mutacije, kao što je F486L (24).N439K vrlo je popularan u Europi i čini veliki dio niza iz Škotske i Irske u Europi (22, 25).K417N postoji u lozi B.1.351 koja je prvi put otkrivena u Južnoj Africi (10).Još jedna mutacija koja trenutno zabrinjava je N501Y, koja je prisutna u B.1.351 i također u B.1.1.7 lozi izvorno identificiranoj u Ujedinjenom Kraljevstvu (9).Naša karta pokazuje da N501Y nema nikakav učinak na antitijela REGN-COV2, već samo umjeren učinak na LY-CoV016 (Slika 3).
Za svako protutijelo ili kombinaciju protutijela, od 11. siječnja 2021., među 317 866 visokokvalitetnih sekvenci SARS-CoV-2 izvedenih od ljudi na GISAID-u (26), odnos između rezultata izbjegavanja za svaku mutaciju i njezine učestalosti.Označeno je.REGN-COV2 koktel escape mutacija E406W zahtijeva višestruke promjene nukleotida u sekvenci Wuhan-Hu-1 RBD, a nije uočena u sekvenci GISAID.Druge mutacije ostatka E406 (E406Q i E406D) primijećene su uz brojanje niske frekvencije, ali ove mutirane aminokiseline nisu jednonukleotidne mutacije daleko od W.
Kao što se i očekivalo, escape mutacije obično se javljaju u sučelju antitijelo-RBD.Međutim, sama struktura nije dovoljna da se predvidi koje mutacije posreduju u bijegu.Na primjer, LY-CoV016 koristi svoje teške i lake lance za vezanje na široki epitop koji se preklapa s površinom vezanja ACE2, ali proces izlaska uključuje mutacije u RBD ostacima u regiji koja određuje komplementarnost teškog lanca (Slika 4A i Slika S6, E do G).Nasuprot tome, bijeg iz REGN10933 i REGN10987 uglavnom se dogodio na RBD ostacima naslaganim na granici teških i lakih lanaca antitijela (Slika 4A i Slika S6, A do D).Mutacija E406W koja je pobjegla iz mješavine REGN-COV2 pojavila se na ostacima koji nisu bili u kontaktu ni s jednim protutijelom (Slika 4, A i B).Iako je E406 strukturno bliži LY-CoV016 (Slika 4B i Slika S6H), mutacija E406W ima mnogo manji učinak na antitijelo (Slika 1, B i C), što ukazuje da je specifični strukturni mehanizam dugog dometa anti-REGN - COV2 antitijelo (Slika S6I).Ukratko, mutacije na RBD ostacima u kontaktu s antitijelima ne posreduju uvijek u bijegu, a neke značajne mutacije u bijegu javljaju se na ostacima koji nisu u kontaktu s antitijelima (Slika 4B i Slika S6, D i G).
(A) Dijagram izlaza projiciran na RBD strukturu vezanu antitijelom.[REGN10933 i REGN10987: Baza podataka proteina (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].Varijabilne domene teških i lakih lanaca protutijela prikazane su kao plavi crteži, a boja na površini RBD-a označava snagu bijega posredovanog mutacijom na ovom mjestu (bijela označava da nema izlaza, a crvena označava najjači mjesto izlaska antitijela ili smjese) .Mjesta koja nisu funkcionalno mutirana zasivljena su.(B) Za svako protutijelo, klasificirajte mjesto kao izravni kontakt s protutijelima (atomi koji nisu vodikovi unutar 4Å od protutijela), proksimalno protutijelo (4 do 8Å) ili distalno protutijelo (> 8Å).Svaka točka predstavlja mjesto, podijeljeno na mjesto za bijeg (crveno) ili mjesto za bijeg (crno).Siva isprekidana linija predstavlja kritičnu vrijednost koja se koristi za klasifikaciju mjesta kao mjesta za bijeg ili ne za bijeg (za detalje, pogledajte Materijali i metode).Crveni i crni brojevi pokazuju koliko je stranica u svakoj kategoriji izbjegnuto ili ne izbjegnuto.
U ovoj smo studiji u potpunosti mapirali mutacije koje izbjegavaju tri glavna anti-SARS-CoV-2 antitijela.Ove karte pokazuju da je prethodna karakterizacija escape mutacija nepotpuna.Nisu identificirane pojedinačne mutacije aminokiselina koje mogu izbjeći dva antitijela u koktelu REGN-COV2, niti su identificirale većinu pacijenata s perzistentnom infekcijom liječenih koktelom.mutacija.Naravno, naša karta još nije odgovorila na najhitnije pitanje: hoće li SARS-CoV-2 razviti opsežnu otpornost na ova antitijela?Ali ono što je sigurno je da je zabrinjavajuće da toliko mnogo escape mutacija ima mali učinak na RBD savijanje ili afinitet receptora, a već postoje neke mutacije niske razine u cirkulirajućim virusima.Na kraju, potrebno je pričekati i promatrati kakve će mutacije SARS-CoV-2 prenijeti kada se proširi među stanovništvom.Naš će rad pomoći "promatranju" trenutnim objašnjavanjem utjecaja mutacija klasificiranih nadzorom virusnog genoma.
Ovo je članak s otvorenim pristupom koji se distribuira pod uvjetima licence Creative Commons Attribution.Članak dopušta neograničenu uporabu, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju pod uvjetom da je izvorno djelo ispravno citirano.
Napomena: samo vas molimo da navedete svoju adresu e-pošte kako bi osoba koju preporučite stranici znala da želite da vidi e-poštu i da nije spam.Nećemo uhvatiti nijednu adresu e-pošte.
Ovo se pitanje koristi za provjeru jeste li posjetitelj i sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Potpuna karta SARS-CoV-2 mutacija koje izmiču mješavini monoklonskih antitijela Regeneron pomaže objasniti evoluciju virusa u liječenju pacijenata.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Potpuna karta SARS-CoV-2 mutacija koje izmiču mješavini monoklonskih antitijela Regeneron pomaže objasniti evoluciju virusa u liječenju pacijenata.
©2021 Američka udruga za napredak znanosti.Sva prava pridržana.AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Vrijeme objave: 24. veljače 2021