Számos antitest már használatban van vagy fejlesztés alatt áll a COVID-19 kezelésére szolgáló terápiaként.A súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) új változatainak megjelenésével fontos előre jelezni, hogy továbbra is fogékonyak lesznek-e az antitestterápiára.Starr et al.Élesztőgomba-könyvtárat használtak, amely lefedi a SARS-CoV-2 receptorkötő domén minden olyan mutációját, amely nem fogja erősen megzavarni a gazdareceptorhoz (ACE2) való kötődését, és feltérképezte, hogy ezek a mutációk hogyan befolyásolják a három fő anti-SARS-CoV. -2 antitest kötődés.Ezek az ábrák azonosítják azokat a mutációkat, amelyek elkerülik az antitestek megkötését, beleértve azokat az egyedi mutációkat is, amelyek elkerülik a Regeneron antitest-keverék két antitestét.Sok olyan mutáció terjed el az emberekben, amelyek egyetlen antitestet elkerülnek.
Az antitestek potenciális terápiát jelentenek a súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) kezelésében, de nem világos, hogy a vírus azért fejlődik ki, hogy elkerülje a kockázatukat.Itt feltérképezzük, hogy a SARS-CoV-2 receptorkötő domén (RBD) összes mutációja hogyan befolyásolja a REGN-COV2 koktél kötődését az LY-CoV016 antitesthez.Ezek a teljes térképek feltártak egy aminosavmutációt, amely teljesen elkerülte a REGN-COV2 keveréket, amely két REGN10933 és REGN10987 antitestből áll, amelyek különböző szerkezeti epitópokat céloznak meg.Ezek az ábrák azonosítják a REGN-COV2-vel kezelt, tartósan fertőzött betegekben és az in vitro vírusszökés során kiválasztott vírusmutációkat is.Végül ezek a számok azt mutatják, hogy a keringő SARS-CoV-2 törzsekben már jelen vannak olyan mutációk, amelyek egyetlen ellenanyagból kikerülnek.Ezek a teljes menekülési térképek megmagyarázhatják a vírusfelügyelet során megfigyelt mutációk következményeit.
Antitesteket fejlesztenek a súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) kezelésére (1).Bizonyos más vírusok elleni antitesteket hatástalanná tehetnek a fertőzött betegek kezelése során kiválasztott vírusmutációk (2, 3), vagy olyan vírusmutációk, amelyek világszerte elterjedtek, hogy rezisztenciát biztosítsanak a teljes vírusklád számára.Ezért annak meghatározása, hogy mely SARS-CoV-2 mutációk képesek elkerülni a kulcsfontosságú antitesteket, kritikus fontosságú annak felméréséhez, hogy a vírusmegfigyelés során megfigyelt mutációk hogyan befolyásolják az antitestterápia hatékonyságát.
A legtöbb vezető SARS-CoV-2 elleni antitest a vírusreceptor-kötő domént (RBD) célozza meg, amely közvetíti az angiotenzin konvertáló enzim 2 (ACE2) receptorhoz való kötődést (5, 6).A közelmúltban kifejlesztettünk egy mélymutációs szkennelési módszert annak feltérképezésére, hogy az RBD összes mutációja hogyan befolyásolja működését és vírusellenes antitestek általi felismerését (7, 8).A módszer magában foglalja az RBD-mutánsok könyvtárának létrehozását, az élesztő felszínén történő expresszálását, valamint a fluoreszcenciával aktivált sejtválogatást és a mélyszekvenálást annak meghatározására, hogy az egyes mutációk hogyan befolyásolják az RBD feltekeredését, az ACE2-affinitást (titrálási sorozatban mérve) és az antitestkötést. (S1A ábra).Ebben a vizsgálatban a (7) pontban leírt ismétlődő mutáns könyvtárat használtuk, amely vonalkódolt RBD-változatokból áll, és a 3819 lehetséges aminosavmutációból 3804-et lefed.Könyvtárunkat a Wuhan-Hu-1 korai izolátum RBD genetikai hátteréből készítettük.Bár számos mutáns gyakorisága növekszik, még mindig ezek jelentik a leggyakoribb RBD-szekvenciákat (9, 10).Megrajzoltunk kettőt a 2034 mutáció közül, amelyek nem zavarják meg erősen az RBD hajtogatását és az ACE-kötést (7), a REGN-COV2 koktél átadását (REGN10933 és REGN10987) (11, 12) és az Eli Lilly-féle LY-CoV016-ot A rekombináns formája az antitest befolyásolja az antitest (CB6-nak vagy JS016-nak is nevezik) megkötésének módszerét (13) (S1B. ábra).A REGN-COV2 a közelmúltban kapott sürgősségi felhasználási engedélyt a COVID-19-re (14), míg az LY-CoV016 jelenleg 3. fázisú klinikai vizsgálatokon megy keresztül (15).
A [Glu406→Trp(E406W)] erősen elkerülte a két antitest keverékét (1A. ábra).Az LY-CoV016 szökési térképe számos menekülési mutációt is feltárt az RBD különböző helyein (1B. ábra).Bár egyes menekülési mutációk ronthatják az RBD azon képességét, hogy kötődjön az ACE2-hez, vagy megfelelően hajtogatott formában expresszálódjon, az élesztőben megjelenített RBD-t használó mélymutációs szkennelés korábbi mérései szerint sok funkcionális mutációnak nincs vagy alig van hatása ezekre a funkcionális tulajdonságokra (7) ) (1. ábra, A és B az ACE2 affinitás elvesztését, míg az S2 ábra az RBD expresszió csökkenését mutatja.
(A) Az antitest feltérképezése REGN-COV2-ben.A bal oldali vonaldiagram az RBD minden helyén a kilépést mutatja (az egyes helyeken található összes mutáció összege).A jobb oldali logókép az erős menekülési helyet mutatja (lila aláhúzás).Az egyes betűk magassága arányos az aminosavmutáció által közvetített szökés erősségével, és minden mutáció 1-es „menekülési pontszáma” teljes szökésnek felel meg.Az y-tengely skála soronként más és más, így például az E406W minden REGN antitestet kiszökik, de a koktéloknál ez a legnyilvánvalóbb, mert túlterheli az egyes antitestek többi menekülési helye.A méretezhető változat esetében az S2, A és B színt használják a térkép színezésére aszerint, hogy a mutációk hogyan befolyásolják a hajtogatott RBD expresszióját.Az S2-t, C-t és D-t használják az ACE2-affinitásra és az RBD-expresszióra gyakorolt hatás elosztására a keringő vírusizolátumokban megfigyelt összes mutáció között.(B) Az (A) ábrának megfelelően rajzolja meg az LY-CoV016-ot.(C) Használjon tüskés pszeudotípusú lentivírus részecskéket a neutralizációs vizsgálat kulcsfontosságú mutációinak ellenőrzésére.Úgy döntöttünk, hogy ellenőrizzük azokat a mutációkat, amelyek várhatóan nagyobb hatást fejtenek ki, vagy amelyek nagy gyakorisággal fordulnak elő a keringésben lévő SARS-CoV-2 izolátumokban (például N439K).Mindegyik pont a mutáció medián gátlókoncentrációjának (IC50) a többszörös növekedését jelenti a D614G-t tartalmazó mutáció nélküli vad típusú (WT) csúcsához képest.A kék szaggatott vonal 1 a WT-hez hasonló semlegesítési hatást jelöl, a > 1 érték pedig a megnövekedett semlegesítési ellenállást.A pont színe jelzi, hogy el akar-e menekülni a térképről.A pontok azt jelzik, hogy mivel az IC50 kívül esik az alkalmazott hígítási sorozaton, a többszörös változást a rendszer ellenőrzi (felső vagy alsó határ).A legtöbb mutánst két példányban tesztelik, tehát két pont van.A teljes semlegesítési görbe a 2. ábrán látható. S3.Az aminosavak egybetűs rövidítései a következők: A, Ala;C, cisztein;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, övé;én, Ile;K: lizin;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gin;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W: triptofán;és Y, Tyr.
A kulcsmutációk antigén hatásának igazolása érdekében neutralizációs vizsgálatot végeztünk pánik pszeudotipizált lentivírus részecskékkel, és megállapítottuk, hogy konzisztencia van az antitestkötő menekülési térkép és a neutralizációs vizsgálat között (1C ábra és S3 ábra).Ahogy az a REGN-COV2 antitesttérkép alapján várható, a 486. pozícióban lévő mutációt csak a REGN10933 semlegesíti, míg a 439. és 444. pozícióban lévő mutációt csak a REGN10987 semlegesíti, így ezek a mutációk nem menekülhetnek el.De az E406W megszökött a két REGN-COV2 antitesttől, így a keverékből is erősen.A szerkezeti elemzés és a vírusmenekülés szelekciója révén Regeneron úgy véli, hogy egyetlen aminosavmutáció sem képes kikerülni a koktélban lévő két antitestet (11, 12), de teljes térképünk az E406W-t koktélmenekülési mutációként azonosítja.Az E406W viszonylag specifikus módon hat a REGN-COV2 antitestre, és nem zavarja komolyan az RBD működését, mert csak kismértékben csökkenti az LY-CoV016 semlegesítő hatását (1C. ábra) és a tüskés pszeudotípusú lentivírus részecskék titerét ( ábra S3F).
Annak feltárása érdekében, hogy a szökési térképünk összhangban van-e az antitestszelekció alatti vírusok evolúciójával, először a Regeneron vírus szökési szelekciós kísérlet adatait ellenőriztük, amelyben az expressziós tüskét sejttenyészetben növesztettük bármilyen REGN10933 jelenlétében. szájgyulladás vírus (VSV), REGN10987 vagy REGN-COV2 koktél (12).Ez a munka öt menekülési mutációt azonosított a REGN10933-ból, két menekülési mutációt a REGN10987-ből, és egyetlen mutációt sem a koktélból (2A ábra).A mind a hét sejttenyészet által kiválasztott mutációk kiemelve vannak a szökési térképünkön, és a Wuhan-Hu-1 RBD szekvenciában a vad típusú kodon egy nukleotidos változása is elérhető (2B ábra), jelezve a szökések közötti különbséget Concordance grafikon és a vírus evolúciója antitestnyomás alatt sejttenyészetben.Érdemes megjegyezni, hogy az E406W nem érhető el egyetlen nukleotid változtatással, ami magyarázatot adhat arra, hogy a Regeneron koktél szelekció miért nem tudja azonosítani, annak ellenére, hogy viszonylag jó az RBD hajtogatása és az ACE2 affinitása.
(A) Antitestek jelenlétében a Regeneron panicle pszeudotípusú VSV-t használ a vírusmenekülési mutációk kiválasztására sejttenyészetben (12).(B) A szökési diagram, ahogy az 1A. ábrán látható, de csak a Wuhan-Hu-1 szekvenciában egyetlen nukleotid változtatással elérhető mutációkat mutatja.A nem szürke a sejtkultúrában (piros) és a fertőzött betegekben (kék) vagy mindkettőben (lila) mutatkozó mutációkat jelöli.Az S5 ábrán láthatók ezek a grafikonok, amelyek aszerint vannak színezve, hogy a mutációk hogyan befolyásolják az ACE2 affinitását vagy az RBD expresszióját.(C) Az RBD-mutáció kinetikája REGN-COV2-vel kezelt betegeknél a fertőzés 145. napján (fekete pontozott függőleges vonal).Az E484A és az F486I közötti kapcsolódás gyakorisága nőtt, de mivel az E484A nem menekülési mutáció az ábránkon, más paneleken nem látható.Lásd még az ábrát.S4.(D) A sejttenyészetben és a fertőzött betegekben előforduló menekülési mutációk egyetlen nukleotidon keresztül elérhetők, és az menekülő antitestek megkötése nem okoz jelentősebb költséget az ACE2 affinitásához [az élesztő megjelenítési módszerrel mérve (7)].Minden pont egy mutáció, és alakja és színe jelzi, hogy elérhető-e és kiválasztható-e a vírus növekedése során.Az x-tengely több jobb oldali pontja erősebb antitestkötési szökést jelez;az y tengely magasabb pontjai nagyobb ACE2 affinitást jeleznek.
Annak megállapítása érdekében, hogy az Escape Atlas képes-e elemezni az embert megfertőző vírusok fejlődését, egy tartósan fertőzött, immunhiányos betegtől származó mély szekvenálási adatokat vizsgáltunk meg, aki a COVID-19 kezelés diagnosztizálását követő 145. napon REGN-COV2-t kapott (16).A késői kezelés lehetővé teszi a beteg víruspopulációjának genetikai diverzitás felhalmozódását, amelyek egy részét az immunstressz vezetheti, mivel a betegnek gyenge autoneutralizáló antitestválasza van a kezelés előtt (16).A REGN-COV2 beadása után az RBD-ben az öt aminosavmutáció gyakorisága gyorsan megváltozott (2C. ábra és S4. ábra).Menekülési térképünk azt mutatta, hogy ezek közül a mutációk közül három elkerülte a REGN10933-at, egy pedig a REGN10987-et (2B. ábra).Érdemes megjegyezni, hogy az antitestkezelés után nem minden mutáció került át a rögzített helyre.Éppen ellenkezőleg, a verseny növekszik és hanyatlik (2C. ábra).Ezt a mintát más vírusok adaptív gazdáinak belső fejlődésében is megfigyelték (17, 18), valószínűleg a genetikai szabadlovaglás és a vírusvonalak közötti versengés miatt.Úgy tűnik, hogy mindkét erő szerepet játszik a tartós fertőzésben szenvedő betegekben (2C. ábra és S4C. ábra): az E484A (diagramunkon nem menekülési mutáció) és az F486I (menekülési REGN10933) a kezelés után szabadon lovagol, valamint az N440D-t hordozó víruscsalád A Q493K (amely a REGN10987 és a REGN10933 szökését eredményezte) először versengett a REGN10933 menekülő mutáns Y489H-val, majd az E484A és F486I és Q493K hordozó vonallal.
A REGN-COV2-vel kezelt betegek négy menekülési mutációja közül hármat nem azonosítottak a Regeneron-féle vírussejtkultúra szelekció során (2B. ábra), ami szemlélteti a teljes térkép előnyeit.A vírusszelekció nem teljes, mert csak az adott sejttenyésztési kísérletben véletlenszerűen kiválasztott mutációkat tudják azonosítani.Ellenkezőleg, a teljes térkép az összes mutációt annotálja, amelyek tartalmazhatnak olyan mutációkat is, amelyeket a kezeléssel nem összefüggő okok okoztak, de véletlenül befolyásolják az antitestkötést.
Természetesen a vírusok evolúcióját befolyásolják a funkcionális korlátok és az antitestek elkerülésére irányuló nyomás.A sejttenyészetben kiválasztott mutációk és betegek mindig megfelelnek a következő kritériumoknak: elkerülik az antitestek megkötését, egyetlen nukleotid változtatással bejuthatnak, és csekély vagy egyáltalán nem költséges az ACE2 affinitása [a korábbi mélymutációk révén, amelyeket élesztő pásztázási méréssel RBD (7) )] (2D ábra és S5 ábra).Ezért egy teljes térképet arról, hogy a mutációk hogyan hatnak az RBD kulcsfontosságú biokémiai fenotípusaira (mint például az ACE- és az antitest-kötődésre), felhasználható a vírus evolúciójának lehetséges útjainak felmérésére.Az egyik figyelmeztetés az, hogy hosszabb evolúciós időkeretben, amint azt a vírusimmunitásban és a gyógyszerszökésben megfigyelték, az episztatikus kölcsönhatások miatt a mutációk toleranciatere megváltozhat (19-21).
A teljes térkép lehetővé teszi számunkra, hogy értékeljük a keringő SARS-CoV-2 meglévő szökési mutációit.2021. január 11-én ellenőriztük az összes rendelkezésre álló, humán eredetű SARS-CoV-2 szekvenciát, és azt találtuk, hogy nagyszámú RBD mutáció elkerülte egy vagy több antitestet (3. ábra).Azonban az egyetlen menekülési mutáció, amely a szekvencia >0,1%-ában jelen van, a REGN10933 escape mutáns Y453F [a szekvencia 0,3%-a;lásd (12)], REGN10987 escape mutáns N439K [a szekvencia 1,7%-a;lásd az 1C. és (22) ábrát], valamint az LY-CoV016 K417N mutációt (0,1%-os szekvencia; lásd még az 1C. ábrát).Az Y453F a hollandiai és dániai nercfarmokhoz kapcsolódó független járványkitörésekhez kapcsolódik (23, 24);érdemes megjegyezni, hogy maga a nercszekvencia néha más menekülési mutációkat is tartalmaz, mint például az F486L (24).Az N439K nagyon népszerű Európában, és a Skóciából és Írországból származó sorozat nagy részét alkotja Európában (22, 25).A K417N a B.1.351 törzsben létezik, amelyet először Dél-Afrikában fedeztek fel (10).Egy másik, jelenleg aggodalomra okot adó mutáció az N501Y, amely a B.1.351-ben és az eredetileg az Egyesült Királyságban azonosított B.1.1.7-es vonalban is megtalálható (9).Térképünk azt mutatja, hogy az N501Y nincs hatással a REGN-COV2 antitestre, de csak mérsékelt hatással van az LY-CoV016-ra (3. ábra).
2021. január 11-én minden egyes antitestre vagy antitest-kombinációra vonatkozóan a GISAID 317 866 kiváló minőségű, humán eredetű SARS-CoV-2 szekvenciája (26) között az egyes mutációk menekülési pontszáma és gyakorisága közötti kapcsolat.Meg van jelölve.A REGN-COV2 koktél escape mutáció E406W többszörös nukleotid változtatást igényel a Wuhan-Hu-1 RBD szekvenciában, és nem figyelhető meg a GISAID szekvenciában.Az E406 oldallánc egyéb mutációit (E406Q és E406D) figyelték meg alacsony gyakoriságú számlálással, de ezek a mutáns aminosavak nem egyetlen nukleotid mutációk, amelyek távol állnak a W-től.
Ahogy az várható volt, az menekülési mutációk általában az antitest-RBD határfelületen fordulnak elő.A szerkezet azonban önmagában nem elég ahhoz, hogy megjósoljuk, mely mutációk közvetítik a szökést.Például az LY-CoV016 nehéz és könnyű láncait használja arra, hogy egy széles epitóphoz kötődjön, amely átfedésben van az ACE2 kötőfelületével, de a szökési folyamat magában foglalja az RBD-maradékok mutációit a nehéz lánc komplementaritást meghatározó régiójában (4A ábra és S6, E. ábra). G).Ezzel szemben a REGN10933-ból és a REGN10987-ből való szökés főleg az antitest nehéz- és könnyűláncainak határfelületén halmozott RBD-maradékoknál fordult elő (4A. ábra és S6. ábra, A-D).A REGN-COV2 keverékből kikerülő E406W mutáció azoknál a maradékoknál fordult elő, amelyek egyik antitesttel sem érintkeztek (4. ábra, A és B).Bár az E406 szerkezetileg közelebb áll az LY-CoV016-hoz (4B. ábra és S6H. ábra), az E406W mutáció sokkal kisebb hatással van az antitestre (1., B. és C. ábra), ami azt jelzi, hogy a specifikus hosszú távú szerkezeti mechanizmus anti-REGN. - COV2 antitest (S6I. ábra).Összefoglalva, az antitestekkel érintkező RBD-maradékok mutációi nem mindig közvetítik a szökést, és néhány jelentős menekülési mutáció előfordul az antitestekkel nem érintkező aminosavaknál (4B. ábra és S6, D és G ábra).
(A) Az antitest által megkötött RBD-struktúrára vetített szökési diagram.[REGN10933 és REGN10987: Protein Database (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: EKT azonosítója 7C01 (13)].Az antitest nehéz és könnyű láncainak variábilis doménjei kék rajzfilmekként jelennek meg, az RBD felületén lévő szín pedig a mutáció által közvetített szökés erősségét jelzi ezen a helyen (a fehér azt jelzi, hogy nincs szökés, a piros pedig a legerősebbet az antitest vagy keverék menekülési helye).A funkcionálisan nem mutált webhelyek szürkén jelennek meg.(B) Minden antitest esetében osztályozza a helyet közvetlen antitest-kontaktusként (nem hidrogénatomok az antitest 4Å-en belül), proximális antitest (4-8Å) vagy disztális antitest (> 8Å).Minden pont egy helyet jelöl, amely menekülési (piros) és nem menekülési (fekete) részekre van osztva.A szürke szaggatott vonal azt a kritikus értéket jelöli, amely alapján a helyszínt menekülési vagy nem menekülési osztályba sorolják (a részletekért lásd: Anyagok és módszerek).A piros és fekete számok azt jelzik, hogy az egyes kategóriákban hány webhely van megtisztítva vagy nem.
Ebben a tanulmányban teljesen feltérképeztük azokat a mutációkat, amelyek elkerülik a három fő SARS-CoV-2 elleni antitestet.Ezek a térképek azt mutatják, hogy a szökési mutációk korábbi jellemzése nem teljes.A REGN-COV2 koktélban lévő két antitestet egyetlen aminosavmutációt sem azonosították, és nem azonosították a koktéllal kezelt, tartós fertőzésben szenvedő betegek többségét sem.mutáció.Természetesen térképünk még nem válaszolt a legégetőbb kérdésre: vajon a SARS-CoV-2 kiterjedt rezisztenciát fog kifejleszteni ezekkel az antitestekkel szemben?Az azonban bizonyos, hogy aggasztó, hogy a sok menekülési mutációnak csekély hatása van az RBD feltekeredésére vagy a receptor affinitására, és máris van néhány alacsony szintű mutáció a keringő vírusokban.Végül meg kell várni, és megfigyelni, hogy a SARS-CoV-2 milyen mutációkat fog továbbítani, amikor elterjed a lakosság körében.Munkánk segíti a „megfigyelést” azáltal, hogy azonnal elmagyarázzuk a vírusgenom-felügyelet által minősített mutációk hatását.
Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amelyet a Creative Commons Attribution License feltételei szerint terjesztenek.A cikk lehetővé teszi a korlátlan felhasználást, terjesztést és reprodukálást bármilyen médiában, feltéve, hogy az eredeti műre megfelelően hivatkoznak.
Megjegyzés: Csak azért kérjük meg e-mail címét, hogy az oldalra ajánlott személy tudja, hogy szeretné látni az e-mailt, és az nem spam.E-mail címeket nem rögzítünk.
Ez a kérdés annak tesztelésére szolgál, hogy Ön látogató-e, és megakadályozza az automatikus spamküldést.
Tyler N. Starr, Allison J. Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
A Regeneron monoklonális antitestek keverékéből kikerülő SARS-CoV-2 mutációk teljes térképe segít megmagyarázni a vírus evolúcióját a betegek kezelésében.
Tyler N. Starr, Allison J. Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
A Regeneron monoklonális antitestek keverékéből kikerülő SARS-CoV-2 mutációk teljes térképe segít megmagyarázni a vírus evolúcióját a betegek kezelésében.
©2021 American Association for the Advancement of Science.minden jog fenntartva.Az AAAS a HINARI, az AGORA, az OARE, a CHORUS, a CLOCKSS, a CrossRef és a COUNTER.Science ISSN 1095-9203 partnere.
Feladás időpontja: 2021.02.24