Beberapa antibodi sudah digunakan atau sedang dikembangkan sebagai terapi pengobatan COVID-19.Dengan munculnya varian baru virus corona sindrom pernapasan akut parah 2 (SARS-CoV-2), penting untuk memprediksi apakah varian tersebut masih rentan terhadap terapi antibodi.Starr dkk.Perpustakaan ragi digunakan, yang mencakup semua mutasi pada domain pengikatan reseptor SARS-CoV-2 yang tidak akan terlalu mengganggu pengikatan pada reseptor inang (ACE2), dan memetakan bagaimana mutasi ini memengaruhi ketiga anti-SARS-CoV utama. -2 pengikatan antibodi.Angka-angka ini mengidentifikasi mutasi yang lolos dari ikatan antibodi, termasuk mutasi tunggal yang lolos dari dua antibodi dalam campuran antibodi Regeneron.Banyak mutasi yang lolos dari satu antibodi menyebar pada manusia.
Antibodi merupakan terapi potensial untuk pengobatan sindrom pernapasan akut parah virus corona 2 (SARS-CoV-2), namun belum jelas apakah virus ini berkembang untuk menghindari risikonya.Di sini, kami memetakan bagaimana semua mutasi pada domain pengikatan reseptor (RBD) SARS-CoV-2 memengaruhi pengikatan campuran REGN-COV2 ke antibodi LY-CoV016.Peta lengkap ini mengungkapkan mutasi asam amino yang sepenuhnya menghindari campuran REGN-COV2, yang terdiri dari dua antibodi REGN10933 dan REGN10987 yang menargetkan epitop struktural berbeda.Angka-angka ini juga mengidentifikasi mutasi virus yang dipilih pada pasien terinfeksi persisten yang diobati dengan REGN-COV2 dan selama seleksi pelepasan virus secara in vitro.Terakhir, angka-angka ini mengungkapkan bahwa mutasi yang lolos dari satu antibodi sudah ada pada strain SARS-CoV-2 yang bersirkulasi.Peta pelarian virus yang lengkap ini dapat menjelaskan konsekuensi mutasi yang diamati selama pengawasan virus.
Antibodi sedang dikembangkan untuk mengobati sindrom pernapasan akut parah virus corona 2 (SARS-CoV-2) (1).Antibodi terhadap virus tertentu lainnya dapat menjadi tidak efektif karena mutasi virus yang dipilih selama pengobatan pasien yang terinfeksi (2, 3) atau mutasi virus yang telah menyebar secara global sehingga menimbulkan resistensi terhadap seluruh kelompok virus.Oleh karena itu, menentukan mutasi SARS-CoV-2 mana yang dapat lolos dari antibodi utama sangat penting untuk menilai bagaimana mutasi yang diamati selama pengawasan virus memengaruhi efektivitas terapi antibodi.
Sebagian besar antibodi anti-SARS-CoV-2 menargetkan domain pengikat reseptor virus (RBD), yang memediasi pengikatan pada reseptor angiotensin-converting enzim 2 (ACE2) (5, 6).Baru-baru ini, kami telah mengembangkan metode pemindaian mutasi mendalam untuk memetakan bagaimana semua mutasi RBD memengaruhi fungsi dan pengenalannya oleh antibodi antivirus (7, 8).Metode ini melibatkan pembuatan perpustakaan mutan RBD, mengekspresikannya pada permukaan ragi, dan menggunakan penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi dan pengurutan mendalam untuk mengukur bagaimana setiap mutasi memengaruhi pelipatan RBD, afinitas ACE2 (diukur dalam rangkaian titrasi), dan pengikatan antibodi. (Gambar S1A).Dalam penelitian ini, kami menggunakan perpustakaan mutan berulang yang dijelaskan dalam (7), yang terdiri dari varian RBD berkode, mencakup 3804 dari 3819 kemungkinan mutasi asam amino.Perpustakaan kami disiapkan dari latar belakang genetik RBD dari isolat awal Wuhan-Hu-1.Meskipun frekuensi beberapa mutan meningkat, mereka masih mewakili rangkaian RBD yang paling umum (9, 10).Kami telah menggambar dua mutasi tahun 2034 yang tidak terlalu mengganggu pelipatan RBD dan pengikatan ACE (7) cara melewatkan koktail REGN-COV2 (REGN10933 dan REGN10987) (11, 12) dan LY-CoV016 karya Eli Lilly Bentuk rekombinan dari antibodi mempengaruhi metode pengikatan antibodi (juga disebut CB6 atau JS016) (13) (Gambar S1B).REGN-COV2 baru-baru ini diberikan izin penggunaan darurat untuk COVID-19 (14), sementara LY-CoV016 saat ini sedang menjalani uji klinis fase 3 (15).
[Glu406→Trp(E406W)] lolos dengan kuat dari campuran dua antibodi (Gambar 1A).Peta pelepasan LY-CoV016 juga mengungkapkan banyak mutasi pelepasan di berbagai lokasi di RBD (Gambar 1B).Meskipun beberapa mutasi yang lepas dapat mengganggu kemampuan RBD untuk berikatan dengan ACE2 atau berekspresi dalam bentuk lipatan yang tepat, menurut pengukuran pemindaian mutasi mendalam sebelumnya menggunakan RBD yang ditampilkan ragi, banyak mutasi fungsional memiliki sedikit atau tidak ada efek pada sifat fungsional ini (7 ) (Gambar 1, A dan B menunjukkan hilangnya afinitas ACE2, sedangkan Gambar S2 menunjukkan penurunan ekspresi RBD.
(A) Memetakan antibodi dalam REGN-COV2.Grafik garis di sebelah kiri menunjukkan pelepasan di setiap lokasi di RBD (jumlah seluruh mutasi di setiap lokasi).Gambar logo di sebelah kanan menunjukkan lokasi pelarian yang kuat (garis bawah ungu).Ketinggian setiap huruf sebanding dengan kekuatan pelepasan yang dimediasi oleh mutasi asam amino, dan “skor pelepasan” sebesar 1 untuk setiap mutasi menunjukkan pelepasan yang lengkap.Skala sumbu y berbeda untuk setiap baris, jadi, misalnya, E406W lolos dari semua antibodi REGN, namun skala ini paling jelas terlihat pada koktail karena kewalahan oleh lokasi pelepasan antibodi individu lainnya.Untuk versi skalabel, S2, A dan B, digunakan untuk mewarnai peta berdasarkan pengaruh mutasi terhadap ekspresi RBD terlipat.S2, C dan D digunakan untuk mendistribusikan pengaruh afinitas ACE2 dan ekspresi RBD di antara semua mutasi yang diamati pada isolat virus yang bersirkulasi.(B) Seperti yang ditunjukkan pada (A), gambar LY-CoV016.(C) Gunakan partikel lentiviral dengan pseudotipe lonjakan untuk memverifikasi mutasi kunci dalam uji netralisasi.Kami memilih untuk memverifikasi mutasi yang diperkirakan memiliki dampak lebih besar atau terjadi pada frekuensi tinggi pada isolat SARS-CoV-2 (seperti N439K) yang beredar.Setiap titik mewakili peningkatan kali lipat konsentrasi penghambatan median (IC50) dari mutasi relatif terhadap puncak tipe liar (WT) yang tidak dipetakan yang mengandung D614G.Garis putus-putus biru 1 melambangkan efek netralisasi yang mirip dengan WT, dan nilai > 1 melambangkan peningkatan resistensi netralisasi.Warna titik menunjukkan apakah Anda ingin keluar dari peta.Titik-titik tersebut menunjukkan bahwa karena IC50 berada di luar rangkaian pengenceran yang digunakan, beberapa perubahan diperiksa (batas atas atau bawah).Kebanyakan mutan diuji dalam rangkap dua, jadi ada dua poin.Kurva netralisasi lengkap ditunjukkan pada Gambar 2. S3.Singkatan satu huruf dari residu asam amino adalah sebagai berikut: A, Ala;C, Sistein;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, miliknya;aku, atau;K, lisin;Aku, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptofan;dan Y, Tir.
Untuk memverifikasi efek antigenik dari mutasi kunci, kami melakukan uji netralisasi menggunakan partikel lentiviral pseudotipe malai, dan menemukan bahwa ada konsistensi antara peta pelepasan pengikatan antibodi dan uji netralisasi (Gambar 1C dan Gambar S3).Sesuai yang diharapkan dari peta antibodi REGN-COV2, mutasi pada posisi 486 hanya dinetralkan oleh REGN10933, sedangkan mutasi pada posisi 439 dan 444 hanya dinetralkan oleh REGN10987, sehingga mutasi tersebut tidak dapat lepas.Namun E406W lolos dari dua antibodi REGN-COV2, sehingga juga lolos dari campuran tersebut dengan kuat.Melalui analisis struktural dan seleksi pelepasan virus, Regeneron yakin bahwa tidak ada mutasi asam amino tunggal yang dapat lolos dari dua antibodi dalam campuran (11, 12), namun peta lengkap kami mengidentifikasi E406W sebagai mutasi pelepasan campuran.E406W mempengaruhi antibodi REGN-COV2 dengan cara yang relatif spesifik, dan tidak mengganggu fungsi RBD secara serius, karena hanya sedikit mengurangi efek netralisasi LY-CoV016 (Gambar 1C) dan titer partikel lentiviral pseudotipe berduri ( Gambar S3F).
Untuk menyelidiki apakah peta pelarian kami konsisten dengan evolusi virus dalam seleksi antibodi, pertama-tama kami memeriksa data eksperimen seleksi pelarian virus Regeneron, di mana lonjakan ekspresi ditumbuhkan dalam kultur sel dengan adanya REGN10933 Vesikuler. virus stomatitis (VSV), REGN10987 atau koktail REGN-COV2 (12).Pekerjaan ini mengidentifikasi lima mutasi lolos dari REGN10933, dua mutasi lolos dari REGN10987, dan tidak ada mutasi dari koktail (Gambar 2A).Mutasi yang dipilih oleh ketujuh kultur sel disorot dalam peta pelepasan kami, dan perubahan nukleotida tunggal dari kodon tipe liar dalam rangkaian RBD Wuhan-Hu-1 juga dapat diakses (Gambar 2B), yang menunjukkan perbedaan antara pelepasan grafik dan evolusi virus di bawah tekanan antibodi dalam kultur sel.Perlu dicatat bahwa E406W tidak dapat diakses dengan perubahan nukleotida tunggal, yang mungkin menjelaskan mengapa pemilihan koktail Regeneron tidak dapat mengidentifikasinya meskipun toleransi pelipatan RBD dan afinitas ACE2 relatif baik.
(A) Dengan adanya antibodi, Regeneron menggunakan pseudotipe malai VSV untuk memilih mutasi pelepasan virus dalam kultur sel (12).(B) Diagram escape, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1A, tetapi hanya menunjukkan mutasi yang dapat diakses oleh perubahan nukleotida tunggal dalam urutan Wuhan-Hu-1.Non-abu-abu menunjukkan mutasi pada kultur sel (merah), dan pasien yang terinfeksi (biru), atau keduanya (ungu).Gambar S5 menunjukkan grafik ini, yang diwarnai oleh pengaruh mutasi terhadap afinitas ACE2 atau ekspresi RBD.(C) Kinetika mutasi RBD pada pasien yang diobati dengan REGN-COV2 pada hari ke 145 infeksi (garis vertikal putus-putus hitam).Frekuensi keterkaitan antara E484A dan F486I meningkat, tetapi karena E484A bukan merupakan mutasi yang lolos dari gambar kami, maka hal ini tidak ditampilkan di panel lain.Lihat juga gambar.S4.(D) Mutasi pelepasan yang terjadi pada kultur sel dan pasien yang terinfeksi dapat diakses oleh nukleotida tunggal, dan pengikatan antibodi yang lolos tidak menyebabkan kerugian besar terhadap afinitas ACE2 [sebagaimana diukur dengan metode tampilan ragi (7)].Setiap titik merupakan mutasi, dan bentuk serta warnanya menunjukkan apakah titik tersebut dapat diakses dan dipilih selama pertumbuhan virus.Titik yang lebih kanan pada sumbu x menunjukkan pelepasan ikatan antibodi yang lebih kuat;titik yang lebih tinggi pada sumbu y menunjukkan afinitas ACE2 yang lebih tinggi.
Untuk menentukan apakah Escape Atlas dapat menganalisis evolusi virus yang menginfeksi manusia, kami memeriksa data pengurutan mendalam dari pasien dengan sistem kekebalan tubuh yang lemah dan terus-menerus terinfeksi yang menerima REGN-COV2 pada hari ke-145 setelah diagnosis Pengobatan COVID-19 (16).Pengobatan yang terlambat memungkinkan populasi virus pasien mengakumulasi keragaman genetik, beberapa di antaranya mungkin disebabkan oleh tekanan kekebalan tubuh, karena pasien memiliki respons antibodi autoneutralisasi yang lemah sebelum pengobatan (16).Setelah pemberian REGN-COV2, frekuensi lima mutasi asam amino pada RBD berubah dengan cepat (Gambar 2C dan Gambar S4).Peta pelarian kami menunjukkan bahwa tiga dari mutasi ini lolos dari REGN10933 dan satu mutasi lolos dari REGN10987 (Gambar 2B).Perlu dicatat bahwa setelah pengobatan antibodi, tidak semua mutasi dipindahkan ke lokasi tetap.Sebaliknya, terjadi naik turunnya persaingan (Gambar 2C).Pola ini telah diamati dalam evolusi internal inang adaptif virus lain (17, 18), kemungkinan karena persaingan antara genetika yang terbang bebas dan garis keturunan virus.Kedua kekuatan ini tampaknya berperan pada pasien dengan infeksi persisten (Gambar 2C dan Gambar S4C): E484A (bukan mutasi yang lolos dalam diagram kami) dan F486I (escape REGN10933) yang berkendara bebas setelah pengobatan, dan garis keturunan virus yang membawa N440D Dan Q493K (masing-masing lolos dari REGN10987 dan REGN10933) pertama-tama berkompetisi dengan mutan pelarian REGN10933 Y489H, dan kemudian berkompetisi dengan garis keturunan yang membawa E484A dan F486I dan Q493K.
Tiga dari empat mutasi yang lolos pada pasien yang diobati dengan REGN-COV2 tidak teridentifikasi dalam pemilihan kultur sel virus Regeneron (Gambar 2B), yang menggambarkan keuntungan dari peta lengkap.Seleksi virus tidak lengkap karena mereka hanya dapat mengidentifikasi mutasi apa pun yang dipilih secara acak dalam percobaan kultur sel tertentu.Sebaliknya, peta lengkap menjelaskan semua mutasi, yang mungkin mencakup mutasi yang disebabkan oleh alasan yang tidak terkait dengan pengobatan, namun secara tidak sengaja memengaruhi pengikatan antibodi.
Tentu saja, evolusi virus dipengaruhi oleh keterbatasan fungsional dan tekanan untuk menghindari antibodi.Mutasi dan pasien yang dipilih dalam kultur sel selalu memenuhi kriteria berikut: mereka lolos dari ikatan antibodi, dapat masuk melalui perubahan nukleotida tunggal, dan memiliki sedikit atau tanpa biaya terhadap afinitas ACE2 [melalui mutasi dalam sebelumnya yang ditampilkan menggunakan ragi Pengukuran pemindaian RBD (7 )] (Gambar 2D dan Gambar S5).Oleh karena itu, peta lengkap tentang bagaimana mutasi memengaruhi fenotip biokimia utama RBD (seperti ACE dan pengikatan antibodi) dapat digunakan untuk menilai kemungkinan jalur evolusi virus.Satu peringatan adalah bahwa dalam jangka waktu evolusi yang lebih lama, seperti yang diamati pada kekebalan virus dan pelepasan obat, akibat interaksi epistatik, ruang toleransi untuk mutasi dapat berubah (19-21).
Peta lengkap memungkinkan kita mengevaluasi mutasi pelarian yang ada pada SARS-CoV-2 yang bersirkulasi.Kami memeriksa semua rangkaian SARS-CoV-2 yang diturunkan dari manusia pada 11 Januari 2021 dan menemukan bahwa sejumlah besar mutasi RBD lolos dari satu atau lebih antibodi (Gambar 3).Namun, satu-satunya mutasi lolos yang terdapat pada >0,1% urutan adalah REGN10933 mutan lolos Y453F [0,3% dari urutan;lihat (12)], REGN10987 lolos dari mutan N439K [1,7% dari urutan;lihat Gambar 1C dan (22)], Dan LY-CoV016 lolos dari mutasi K417N (urutan 0,1%; lihat juga Gambar 1C).Y453F dikaitkan dengan wabah independen terkait peternakan cerpelai di Belanda dan Denmark (23, 24);perlu dicatat bahwa rangkaian cerpelai itu sendiri terkadang mengandung mutasi pelarian lainnya, seperti F486L (24).N439K sangat populer di Eropa, dan merupakan bagian besar dari rangkaian dari Skotlandia dan Irlandia di Eropa (22, 25).K417N ada dalam garis keturunan B.1.351 yang pertama kali ditemukan di Afrika Selatan (10).Mutasi lain yang menjadi perhatian saat ini adalah N501Y, yang terdapat pada B.1.351 dan juga pada garis keturunan B.1.1.7 yang awalnya diidentifikasi di Inggris (9).Peta kami menunjukkan bahwa N501Y tidak berpengaruh pada antibodi REGN-COV2, namun hanya berpengaruh sedang terhadap LY-CoV016 (Gambar 3).
Untuk setiap kombinasi antibodi atau antibodi, per 11 Januari 2021, di antara 317.866 rangkaian SARS-CoV-2 berkualitas tinggi yang diturunkan dari manusia di GISAID (26), hubungan antara skor lolosnya setiap mutasi dan frekuensinya.Itu ditandai.Mutasi pelepasan koktail REGN-COV2 E406W memerlukan beberapa perubahan nukleotida dalam rangkaian RBD Wuhan-Hu-1, dan tidak diamati dalam rangkaian GISAID.Mutasi lain dari residu E406 (E406Q dan E406D) diamati dengan penghitungan frekuensi rendah, tetapi asam amino mutan ini bukanlah mutasi nukleotida tunggal yang jauh dari W.
Seperti yang diharapkan, mutasi yang lolos biasanya terjadi pada antarmuka antibodi-RBD.Namun, struktur saja tidak cukup untuk memprediksi mutasi mana yang memediasi pelepasan diri.Misalnya, LY-CoV016 menggunakan rantai berat dan ringannya untuk berikatan dengan epitop lebar yang tumpang tindih dengan permukaan pengikatan ACE2, namun proses pelepasannya melibatkan mutasi pada residu RBD di wilayah penentu saling melengkapi rantai berat (Gambar 4A dan Gambar S6, E hingga G).Sebaliknya, pelepasan dari REGN10933 dan REGN10987 terutama terjadi pada residu RBD yang ditumpuk pada antarmuka rantai berat dan ringan antibodi (Gambar 4A dan Gambar S6, A hingga D).Mutasi E406W yang lolos dari campuran REGN-COV2 terjadi pada residu yang tidak bersentuhan dengan salah satu antibodi (Gambar 4, A dan B).Meskipun E406 secara struktural lebih dekat dengan LY-CoV016 (Gambar 4B dan Gambar S6H), mutasi E406W memiliki efek yang jauh lebih kecil pada antibodi (Gambar 1, B dan C), yang menunjukkan bahwa mekanisme struktural jangka panjang spesifiknya adalah anti-REGN - Antibodi COV2 (Gambar S6I).Ringkasnya, mutasi pada residu RBD yang bersentuhan dengan antibodi tidak selalu memediasi pelepasan, dan beberapa mutasi pelepasan yang signifikan terjadi pada residu yang tidak bersentuhan dengan antibodi (Gambar 4B dan Gambar S6, D dan G).
(A) Diagram escape diproyeksikan pada struktur RBD yang diikat oleh antibodi.[REGN10933 dan REGN10987: Basis Data Protein (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDBID 7C01 (13)].Domain variabel rantai berat dan ringan antibodi ditampilkan sebagai kartun biru, dan warna pada permukaan RBD menunjukkan kekuatan pelepasan yang dimediasi mutasi di situs ini (putih menunjukkan tidak ada pelepasan, dan merah menunjukkan yang terkuat). tempat keluarnya antibodi atau campuran).Situs yang tidak bermutasi secara fungsional akan berwarna abu-abu.(B) Untuk setiap antibodi, klasifikasikan lokasinya menjadi antibodi kontak langsung (atom non-hidrogen dalam jarak 4Å dari antibodi), antibodi proksimal (4 hingga 8Å) atau antibodi distal (> 8Å).Setiap titik mewakili sebuah situs, dibagi menjadi escape (merah) atau non-escape (hitam).Garis putus-putus berwarna abu-abu mewakili nilai kritis yang digunakan untuk mengklasifikasikan situs sebagai escape atau non-escape (untuk detailnya, lihat Bahan dan Metode).Angka merah dan hitam menunjukkan berapa banyak situs di setiap kategori yang lolos atau tidak lolos.
Dalam penelitian ini, kami telah memetakan sepenuhnya mutasi yang menghindari tiga antibodi utama anti-SARS-CoV-2.Peta-peta ini menunjukkan bahwa karakterisasi mutasi pelarian sebelumnya tidak lengkap.Mutasi asam amino tunggal yang dapat lepas dari dua antibodi dalam campuran REGN-COV2 belum teridentifikasi, juga belum mengidentifikasi sebagian besar pasien infeksi persisten yang diobati dengan campuran tersebut.mutasi.Tentu saja, peta kami belum menjawab pertanyaan paling mendesak: Akankah SARS-CoV-2 mengembangkan resistensi yang luas terhadap antibodi ini?Namun yang pasti mengkhawatirkan adalah banyaknya mutasi yang lolos hanya berdampak kecil pada pelipatan RBD atau afinitas reseptor, dan sudah terdapat beberapa mutasi tingkat rendah pada virus yang bersirkulasi.Pada akhirnya, kita perlu menunggu dan mengamati mutasi apa yang akan ditularkan SARS-CoV-2 ketika menyebar ke masyarakat.Pekerjaan kami akan membantu “observasi” dengan segera menjelaskan dampak mutasi yang diklasifikasikan berdasarkan pengawasan genom virus.
Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan berdasarkan ketentuan Lisensi Atribusi Creative Commons.Artikel ini mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam media apa pun dengan syarat karya aslinya dikutip dengan benar.
Catatan: Kami hanya meminta Anda untuk memberikan alamat email Anda sehingga orang yang Anda rekomendasikan ke halaman tersebut mengetahui bahwa Anda ingin mereka melihat email tersebut dan bahwa itu bukan spam.Kami tidak akan menangkap alamat email apa pun.
Pertanyaan ini digunakan untuk menguji apakah Anda pengunjung dan mencegah pengiriman spam otomatis.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Peta lengkap mutasi SARS-CoV-2 yang lolos dari campuran antibodi monoklonal Regeneron membantu menjelaskan evolusi virus dalam merawat pasien.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Peta lengkap mutasi SARS-CoV-2 yang lolos dari campuran antibodi monoklonal Regeneron membantu menjelaskan evolusi virus dalam merawat pasien.
©2021 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Ilmu Pengetahuan.seluruh hak cipta.AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Waktu posting: 24 Februari 2021