Diversi anticorpi sono già in uso o in fase di sviluppo come terapie per il trattamento del COVID-19.Con l’emergere di nuove varianti della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), è importante prevedere se saranno ancora suscettibili alla terapia con anticorpi.Starr et al.È stata utilizzata una libreria di lievito, che copre tutte le mutazioni nel dominio di legame del recettore SARS-CoV-2 che non interrompe in modo significativo il legame con il recettore ospite (ACE2) e mappa il modo in cui queste mutazioni influenzano i tre principali anti-SARS-CoV -2 legame anticorpale.Queste cifre identificano le mutazioni che sfuggono al legame degli anticorpi, comprese le singole mutazioni che sfuggono ai due anticorpi nella miscela di anticorpi Regeneron.Molte mutazioni che sfuggono a un singolo anticorpo si stanno diffondendo negli esseri umani.
Gli anticorpi rappresentano una potenziale terapia per il trattamento della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), ma non è chiaro se il virus si sviluppi per sfuggire al loro rischio.Qui, mappiamo come tutte le mutazioni nel dominio di legame del recettore SARS-CoV-2 (RBD) influenzano il legame del cocktail REGN-COV2 con l’anticorpo LY-CoV016.Queste mappe complete hanno rivelato una mutazione dell’amminoacido che ha eluso completamente la miscela REGN-COV2, che è composta da due anticorpi REGN10933 e REGN10987 che prendono di mira diversi epitopi strutturali.Queste cifre identificano anche le mutazioni del virus selezionate nei pazienti con infezione persistente trattati con REGN-COV2 e durante la selezione della fuga del virus in vitro.Infine, questi dati rivelano che le mutazioni che sfuggono a un singolo anticorpo sono già presenti nei ceppi circolanti di SARS-CoV-2.Queste mappe di fuga complete possono spiegare le conseguenze delle mutazioni osservate durante la sorveglianza del virus.
Sono in fase di sviluppo anticorpi per il trattamento della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (1).Gli anticorpi contro alcuni altri virus possono essere resi inefficaci da mutazioni virali selezionate durante il trattamento di pazienti infetti (2, 3) o da mutazioni virali che si sono diffuse a livello globale per conferire resistenza all'intero clade virale.Pertanto, determinare quali mutazioni SARS-CoV-2 possono sfuggire agli anticorpi chiave è fondamentale per valutare in che modo le mutazioni osservate durante la sorveglianza del virus influenzano l’efficacia della terapia anticorpale.
La maggior parte dei principali anticorpi anti-SARS-CoV-2 prendono di mira il dominio di legame del recettore virale (RBD), che media il legame con il recettore dell’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2) (5, 6).Recentemente, abbiamo sviluppato un metodo di scansione delle mutazioni profonde per mappare il modo in cui tutte le mutazioni di RBD influenzano la sua funzione e il riconoscimento da parte degli anticorpi antivirali (7, 8).Il metodo prevede la creazione di una libreria di mutanti RBD, la loro espressione sulla superficie del lievito e l'utilizzo dello smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza e del sequenziamento profondo per quantificare il modo in cui ciascuna mutazione influisce sul ripiegamento dell'RBD, sull'affinità ACE2 (misurata in una serie di titolazione) e sul legame degli anticorpi (Figura S1A).In questo studio, abbiamo utilizzato la libreria mutante ripetitiva descritta in (7), che è composta da varianti RBD con codice a barre, che coprono 3804 delle 3819 possibili mutazioni di amminoacidi.La nostra libreria è stata preparata dal background genetico RBD del primo isolato Wuhan-Hu-1.Sebbene la frequenza di numerosi mutanti sia in aumento, essi rappresentano ancora le sequenze RBD più comuni (9, 10).Abbiamo disegnato due delle 2034 mutazioni che non interrompono fortemente il ripiegamento RBD e il legame ACE (7) come passare il cocktail REGN-COV2 (REGN10933 e REGN10987) (11, 12) e LY-CoV016 di Eli Lilly La forma ricombinante del l'anticorpo influenza il metodo di legame dell'anticorpo (chiamato anche CB6 o JS016) (13) (Figura S1B).REGN-COV2 ha recentemente ottenuto un'autorizzazione all'uso di emergenza per COVID-19 (14), mentre LY-CoV016 è attualmente sottoposto a studi clinici di fase 3 (15).
[Glu406→Trp(E406W)] è sfuggito fortemente alla miscela di due anticorpi (Figura 1A).La mappa di fuga di LY-CoV016 ha rivelato anche molte mutazioni di fuga in diversi siti di RBD (Figura 1B).Sebbene alcune mutazioni di fuga possano compromettere la capacità di RBD di legarsi a ACE2 o di esprimersi in una forma opportunamente ripiegata, secondo precedenti misurazioni di scansione di mutazioni profonde utilizzando RBD visualizzato nel lievito, molte mutazioni funzionali hanno poco o nessun effetto su queste proprietà funzionali (7 ) (La Figura 1, A e B rappresentano la perdita di affinità ACE2, mentre la Figura S2 rappresenta la diminuzione dell'espressione RBD.
(A) Mappatura dell'anticorpo in REGN-COV2.Il grafico a linee a sinistra mostra la fuga in ciascun sito dell'RBD (la somma di tutte le mutazioni in ciascun sito).L'immagine del logo a destra mostra la forte posizione di fuga (sottolineatura viola).L'altezza di ciascuna lettera è proporzionale alla forza della fuga mediata dalla mutazione dell'amminoacido, e un “punteggio di fuga” pari a 1 per ciascuna mutazione corrisponde a una fuga completa.La scala dell'asse y è diversa per ogni riga, quindi, ad esempio, E406W sfugge a tutti gli anticorpi REGN, ma è più ovvio per i cocktail perché è sopraffatto dagli altri siti di fuga dei singoli anticorpi.Per la versione scalabile, S2, A e B vengono utilizzati per colorare la mappa in base al modo in cui le mutazioni influenzano l'espressione dell'RBD ripiegato.S2, C e D vengono utilizzati per distribuire l'influenza sull'affinità ACE2 e sull'espressione RBD tra tutte le mutazioni osservate negli isolati virali circolanti.(B) Come mostrato in (A), disegna LY-CoV016.(C) Utilizzare particelle lentivirali pseudotipate per verificare le mutazioni chiave nel test di neutralizzazione.Abbiamo scelto di verificare le mutazioni che si prevede abbiano un impatto maggiore o che esistano con una frequenza elevata negli isolati SARS-CoV-2 (come N439K) in circolazione.Ciascun punto rappresenta l'aumento di una volta della concentrazione inibitoria mediana (IC50) della mutazione rispetto al picco del wild-type (WT) non mutato contenente D614G.La linea tratteggiata blu 1 rappresenta un effetto di neutralizzazione simile al WT e un valore> 1 rappresenta una maggiore resistenza alla neutralizzazione.Il colore del punto indica se vuoi scappare dalla mappa.I punti indicano che, poiché l'IC50 è esterno alla serie di diluizioni utilizzata, viene controllato il cambio multiplo (limite superiore o inferiore).La maggior parte dei mutanti viene testata in duplicato, quindi ci sono due punti.La curva di neutralizzazione completa è mostrata nella Figura 2. S3.Le abbreviazioni di una lettera dei residui amminoacidici sono le seguenti: A, Ala;C, cisteina;D, Aspide;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, suo;Io, Ile;K, lisina ;L, Liu;Metropoli N, Assen;P, professionista;Q, Gln;R, Argo;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptofano;e Y, Tyr.
Al fine di verificare l'effetto antigenico delle mutazioni chiave, abbiamo eseguito un test di neutralizzazione utilizzando particelle lentivirali pseudotipate della pannocchia e abbiamo scoperto che esisteva una coerenza tra la mappa di fuga del legame dell'anticorpo e il test di neutralizzazione (Figura 1C e Figura S3).Come previsto dalla mappa degli anticorpi REGN-COV2, la mutazione nella posizione 486 è neutralizzata solo da REGN10933, mentre la mutazione nelle posizioni 439 e 444 è neutralizzata solo da REGN10987, quindi queste mutazioni non possono sfuggire.Ma l’E406W è sfuggito ai due anticorpi REGN-COV2, quindi è sfuggito fortemente anche alla miscela.Attraverso l'analisi strutturale e la selezione della fuga del virus, Regeneron ritiene che nessuna singola mutazione dell'amminoacido possa sfuggire ai due anticorpi nel cocktail (11, 12), ma la nostra mappa completa identifica E406W come una mutazione della fuga dal cocktail.E406W colpisce l'anticorpo REGN-COV2 in modo relativamente specifico e non interferisce seriamente con la funzione di RBD, poiché riduce solo leggermente l'effetto di neutralizzazione di LY-CoV016 (Figura 1C) e il titolo delle particelle lentivirali pseudotipate arricchite (Figura S3F).
Per esplorare se la nostra mappa di fuga è coerente con l'evoluzione dei virus sotto selezione di anticorpi, abbiamo prima controllato i dati dell'esperimento di selezione di fuga del virus Regeneron, in cui il picco di espressione è stato coltivato in coltura cellulare in presenza di qualsiasi REGN10933 Il virus vescicolare virus della stomatite (VSV), REGN10987 o cocktail REGN-COV2 (12).Questo lavoro ha identificato cinque mutazioni di fuga da REGN10933, due mutazioni di fuga da REGN10987 e nessuna mutazione da cocktail (Figura 2A).Le mutazioni selezionate da tutte e sette le colture cellulari sono evidenziate nella nostra mappa di fuga ed è accessibile anche la modifica del singolo nucleotide del codone wild-type nella sequenza RBD Wuhan-Hu-1 (Figura 2B), indicando la differenza tra le fughe Concordanza grafico ed evoluzione del virus sotto pressione anticorpale in coltura cellulare.Vale la pena notare che non è possibile accedere a E406W mediante modifiche del singolo nucleotide, il che potrebbe spiegare perché la selezione del cocktail Regeneron non può identificarlo nonostante la tolleranza relativamente buona del ripiegamento RBD e dell'affinità ACE2.
(A) In presenza di anticorpi, Regeneron utilizza lo pseudotipo VSV a pannocchia per selezionare le mutazioni di fuga del virus nella coltura cellulare (12).(B) Il diagramma di fuga, come mostrato nella Figura 1A, mostra solo le mutazioni accessibili da un singolo cambiamento nucleotidico nella sequenza Wuhan-Hu-1.Non grigio indica mutazioni nella coltura cellulare (rosso) e nei pazienti infetti (blu) o in entrambi (viola).La Figura S5 mostra questi grafici, che sono colorati in base al modo in cui le mutazioni influenzano l'affinità ACE2 o l'espressione RBD.(C) Cinetica della mutazione RBD in pazienti trattati con REGN-COV2 al 145° giorno di infezione (linea verticale tratteggiata nera).La frequenza del collegamento tra E484A e F486I è aumentata, ma poiché E484A non è una mutazione di fuga nella nostra figura, non è mostrata in altri pannelli.Vedi anche figura.S4.(D) Le mutazioni di fuga che si verificano nella coltura cellulare e nei pazienti infetti sono accessibili da un singolo nucleotide e il legame degli anticorpi di fuga non causa alcun costo importante per l'affinità ACE2 [come misurato con il metodo di visualizzazione del lievito (7)].Ogni punto rappresenta una mutazione e la sua forma e colore indicano se è possibile accedervi e selezionarlo durante la crescita del virus.I punti più a destra sull'asse x indicano una fuga di legame dell'anticorpo più forte;i punti più alti sull’asse y indicano una maggiore affinità ACE2.
Al fine di determinare se Escape Atlas può analizzare l’evoluzione dei virus che infettano gli esseri umani, abbiamo esaminato i dati di sequenziamento approfondito di un paziente immunocompromesso con infezione persistente che ha ricevuto REGN-COV2 il 145° giorno dopo la diagnosi del trattamento COVID-19 (16).Il trattamento tardivo consente alla popolazione virale del paziente di accumulare diversità genetica, alcune delle quali possono essere guidate dallo stress immunitario, poiché il paziente ha una debole risposta anticorpale autoneutralizzante prima del trattamento (16).Dopo la somministrazione di REGN-COV2, la frequenza di cinque mutazioni di amminoacidi in RBD è cambiata rapidamente (Figura 2C e Figura S4).La nostra mappa di fuga ha mostrato che tre di queste mutazioni sono sfuggite a REGN10933 e una è sfuggita a REGN10987 (Figura 2B).Vale la pena notare che dopo il trattamento con anticorpi non tutte le mutazioni sono state trasferite al sito fissato.Al contrario, si registra l’ascesa e la caduta della concorrenza (Figura 2C).Questo modello è stato osservato nell'evoluzione interna degli ospiti adattativi di altri virus (17, 18), probabilmente a causa della competizione tra free-riding genetico e lignaggi virali.Entrambe queste forze sembrano svolgere un ruolo nei pazienti con infezione persistente (Figura 2C e Figura S4C): E484A (non una mutazione di fuga nel nostro diagramma) e F486I (fuga REGN10933) free-riding dopo il trattamento e lignaggi virali che trasportano N440D e Q493K (in fuga da REGN10987 e REGN10933, rispettivamente) ha gareggiato prima con il mutante di fuga di REGN10933 Y489H, e poi ha gareggiato con il lignaggio che trasportava E484A e F486I e Q493K.
Tre delle quattro mutazioni di fuga nei pazienti trattati con REGN-COV2 non sono state identificate nella selezione della coltura cellulare virale di Regeneron (Figura 2B), il che illustra il vantaggio della mappa completa.La selezione del virus è incompleta perché possono identificare solo eventuali mutazioni selezionate casualmente in quel particolare esperimento di coltura cellulare.Al contrario, la mappa completa annota tutte le mutazioni, che possono includere mutazioni causate da ragioni non correlate al trattamento, ma che influenzano accidentalmente il legame degli anticorpi.
Naturalmente, l’evoluzione dei virus è influenzata da limitazioni funzionali e dalla pressione per eludere gli anticorpi.Le mutazioni e i pazienti selezionati nella coltura cellulare soddisfano sempre i seguenti criteri: sfuggono al legame degli anticorpi, possono entrare attraverso un singolo cambiamento nucleotidico e hanno un costo minimo o nullo per l'affinità ACE2 [attraverso le precedenti mutazioni profonde visualizzate utilizzando la misurazione della scansione del lievito RBD (7 )] (Figura 2D e Figura S5).Pertanto, una mappa completa di come le mutazioni influenzano i fenotipi biochimici chiave dell’RBD (come ACE e legame con gli anticorpi) può essere utilizzata per valutare i possibili percorsi per l’evoluzione del virus.Un avvertimento è che in un arco di tempo evolutivo più lungo, come osservato nell'immunità virale e nella fuga di farmaci, a causa delle interazioni epistatiche, lo spazio di tolleranza per le mutazioni può cambiare (19-21).
La mappa completa ci consente di valutare le mutazioni di fuga esistenti nel SARS-CoV-2 circolante.Abbiamo controllato tutte le sequenze SARS-CoV-2 di derivazione umana disponibili all'11 gennaio 2021 e abbiamo scoperto che un gran numero di mutazioni RBD sfuggiva a uno o più anticorpi (Figura 3).Tuttavia, l'unica mutazione di fuga presente in >0,1% della sequenza è il mutante di fuga REGN10933 Y453F [0,3% della sequenza;vedere (12)], REGN10987 mutante escape N439K [1,7% della sequenza;vedere Figura 1C e (22)], e la mutazione di fuga di LY-CoV016 K417N (sequenza dello 0,1%; vedere anche Figura 1C).Y453F è associato a focolai indipendenti correlati ad allevamenti di visoni nei Paesi Bassi e in Danimarca (23, 24);vale la pena notare che la stessa sequenza di visone talvolta contiene altre mutazioni di fuga, come F486L (24).N439K è molto popolare in Europa e costituisce gran parte della sequenza proveniente dalla Scozia e dall'Irlanda in Europa (22, 25).K417N esiste nel lignaggio B.1.351 scoperto per la prima volta in Sud Africa (10).Un'altra mutazione di attuale preoccupazione è N501Y, che è presente in B.1.351 e anche nel lignaggio B.1.1.7 originariamente identificato nel Regno Unito (9).La nostra mappa mostra che N501Y non ha alcun effetto sull'anticorpo REGN-COV2, ma solo un effetto moderato su LY-CoV016 (Figura 3).
Per ciascun anticorpo o combinazione di anticorpi, all'11 gennaio 2021, tra le 317.866 sequenze SARS-CoV-2 di alta qualità di derivazione umana su GISAID (26), la relazione tra il punteggio di fuga per ciascuna mutazione e la sua frequenza.È segnato.La mutazione E406W del cocktail escape REGN-COV2 richiede molteplici cambiamenti nucleotidici nella sequenza RBD Wuhan-Hu-1 e non è osservata nella sequenza GISAID.Altre mutazioni del residuo E406 (E406Q ed E406D) sono state osservate con conteggi a bassa frequenza, ma questi amminoacidi mutanti non sono mutazioni di singolo nucleotide lontane da W.
Come previsto, le mutazioni di fuga di solito si verificano nell'interfaccia anticorpo-RBD.Tuttavia, la struttura da sola non è sufficiente per prevedere quali mutazioni mediano la fuga.Ad esempio, LY-CoV016 utilizza le sue catene pesanti e leggere per legarsi a un ampio epitopo che si sovrappone alla superficie di legame ACE2, ma il processo di fuga comporta mutazioni nei residui RBD nella regione che determina la complementarità delle catene pesanti (Figura 4A e Figura S6, da E a G).Al contrario, le fughe da REGN10933 e REGN10987 si sono verificate principalmente sui residui RBD impilati all'interfaccia delle catene pesanti e leggere dell'anticorpo (Figura 4A e Figura S6, da A a D).La mutazione E406W sfuggita alla miscela REGN-COV2 si è verificata su residui che non erano in contatto con nessuno degli anticorpi (Figura 4, A e B).Sebbene E406 sia strutturalmente più vicino a LY-CoV016 (Figura 4B e Figura S6H), la mutazione E406W ha un effetto molto minore sull'anticorpo (Figura 1, B e C), indicando che lo specifico meccanismo strutturale a lungo raggio è anti-REGN - Anticorpo COV2 (Figura S6I).In sintesi, le mutazioni nei residui RBD in contatto con gli anticorpi non sempre mediano la fuga e alcune mutazioni significative di fuga si verificano nei residui non in contatto con gli anticorpi (Figura 4B e Figura S6, D e G).
(A) Il diagramma di fuga proiettato sulla struttura RBD legata dall'anticorpo.[REGN10933 e REGN10987: Database delle proteine (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: ID PDB 7C01 (13)].I domini variabili delle catene pesanti e leggere dell'anticorpo sono mostrati come cartoni blu e il colore sulla superficie dell'RBD indica la forza della fuga mediata dalla mutazione in questo sito (il bianco indica nessuna fuga e il rosso indica la fuga più forte sito di fuga dell'anticorpo o della miscela).I siti che non sono funzionalmente modificati vengono visualizzati in grigio.(B) Per ciascun anticorpo, classificare il sito come contatto diretto con l'anticorpo (atomi non di idrogeno entro 4Å dall'anticorpo), anticorpo prossimale (da 4 a 8Å) o anticorpo distale (> 8Å).Ogni punto rappresenta un sito, suddiviso in fuga (rosso) o non fuga (nero).La linea tratteggiata grigia rappresenta il valore critico utilizzato per classificare il sito come di fuga o di non fuga (per i dettagli, vedere Materiali e metodi).I numeri rosso e nero indicano quanti siti in ciascuna categoria sono sottoposti o meno a escape.
In questo studio, abbiamo mappato completamente le mutazioni che eludono i tre principali anticorpi anti-SARS-CoV-2.Queste mappe indicano che la precedente caratterizzazione delle mutazioni di fuga è incompleta.Non sono state identificate mutazioni di singoli aminoacidi che possano sfuggire ai due anticorpi nel cocktail REGN-COV2, né è stata identificata la maggior parte dei pazienti con infezione persistente trattati con il cocktail.mutazione.Naturalmente, la nostra mappa non ha ancora risposto alla domanda più urgente: SARS-CoV-2 svilupperà un’ampia resistenza a questi anticorpi?Ma quello che è certo è che è preoccupante che così tante mutazioni di fuga abbiano scarso effetto sul ripiegamento dell’RBD o sull’affinità dei recettori, e che ci siano già alcune mutazioni di basso livello nei virus circolanti.Alla fine, è necessario attendere e osservare quali mutazioni trasmetterà il SARS-CoV-2 quando si diffonderà tra la popolazione.Il nostro lavoro aiuterà l’”osservazione” spiegando immediatamente l’impatto delle mutazioni classificate dalla sorveglianza del genoma virale.
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La mappa completa delle mutazioni di SARS-CoV-2 che sfuggono alla miscela di anticorpi monoclonali Regeneron aiuta a spiegare l’evoluzione del virus nella cura dei pazienti.
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La mappa completa delle mutazioni di SARS-CoV-2 che sfuggono alla miscela di anticorpi monoclonali Regeneron aiuta a spiegare l’evoluzione del virus nella cura dei pazienti.
©2021 Associazione americana per il progresso della scienza.tutti i diritti riservati.AAAS è partner di HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Orario di pubblicazione: 24 febbraio 2021