いくつかの抗体が、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の治療法としてすでに使用されているか、開発中です。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) の新たな変異株の出現により、それらが依然として抗体療法の影響を受けやすいかどうかを予測することが重要です。スターら。酵母ライブラリーが使用されました。これは、宿主受容体 (ACE2) への結合を強く阻害しない SARS-CoV-2 受容体結合ドメインのすべての変異をカバーし、これらの変異が 3 つの主要な抗 SARS-CoV にどのように影響するかをマッピングしました。 -2 抗体結合。これらの図は、Regeneron 抗体混合物中の 2 つの抗体を回避する単一変異を含む、抗体結合を回避する変異を特定します。単一の抗体を回避する多くの突然変異がヒトに広がっています。
抗体は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) の治療法となる可能性がありますが、ウイルスがそのリスクを回避するために発生するかどうかは明らかではありません。ここでは、SARS-CoV-2受容体結合ドメイン（RBD）のすべての変異がREGN-COV2カクテルの抗体LY-CoV016への結合にどのように影響するかをマッピングします。これらの完全なマップにより、異なる構造エピトープを標的とする 2 つの抗体 REGN10933 および REGN10987 で構成される REGN-COV2 混合物を完全に回避するアミノ酸変異が明らかになりました。これらの図は、REGN-COV2 で治療された持続感染患者において、および in vitro ウイルス回避選択中に選択されたウイルス変異も特定します。最後に、これらの図は、単一の抗体から逃れる変異が、循環している SARS-CoV-2 株にすでに存在していることを明らかにしています。これらの完全な脱出マップは、ウイルス監視中に観察された突然変異の結果を説明できます。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) を治療するための抗体が開発されています (1)。他の特定のウイルスに対する抗体は、感染患者の治療中に選択されたウイルスの変異 (2、3) や、ウイルスクレード全体に対する耐性を与えるために世界的に広がったウイルスの変異によって無効になる可能性があります。したがって、ウイルス監視中に観察された変異が抗体療法の有効性にどのような影響を与えるかを評価するには、どの SARS-CoV-2 変異が主要な抗体から逃れることができるかを判断することが重要です。
ほとんどの主要な抗 SARS-CoV-2 抗体は、アンジオテンシン変換酵素 2 (ACE2) 受容体への結合を媒介するウイルス受容体結合ドメイン (RBD) を標的としています (5、6)。最近、我々は、RBD のすべての変異がその機能と抗ウイルス抗体による認識にどのような影響を与えるかをマッピングするための深部変異スキャン法を開発しました (7、8)。この方法には、RBD 変異体のライブラリーの作成、酵母の表面上での発現、そして蛍光活性化セルソーティングとディープシーケンシングを使用して、各変異が RBD フォールディング、ACE2 親和性 (滴定シリーズで測定)、および抗体結合にどのような影響を与えるかを定量化することが含まれます。 (図S1A)。この研究では、(7) に記載されている反復変異ライブラリを使用しました。これは、バーコード化された RBD バリアントで構成され、3819 個の可能なアミノ酸変異のうち 3804 個をカバーしています。私たちのライブラリは、初期分離株武漢-Hu-1 の RBD 遺伝的背景から作成されました。いくつかの変異体の頻度は増加していますが、依然として最も一般的な RBD 配列を表しています (9、10)。私たちは、RBD フォールディングと ACE 結合を強く破壊しない 2,034 個の変異のうち 2 つを抽出しました (7) REGN-COV2 カクテル (REGN10933 および REGN10987) (11、12) およびイーライリリーの LY-CoV016 の組換え型を通過させる方法抗体は、抗体（CB6 または JS016 とも呼ばれます）の結合方法に影響を与えます (13) (図 S1B)。REGN-COV2 は最近、新型コロナウイルス感染症 (14) に対する緊急使用許可を与えられましたが、LY-CoV016 は現在第 3 相臨床試験中です (15)。
[Glu406→Trp(E406W)] は 2 つの抗体の混合物から強力に回避されました (図 1A)。LY-CoV016 のエスケープ マップからも、RBD のさまざまな部位で多くのエスケープ変異が明らかになりました (図 1B)。一部のエスケープ突然変異は、RBD が ACE2 に結合する能力や適切に折りたたまれた形で発現する能力を損なう可能性がありますが、酵母表示 RBD を使用した深部突然変異スキャンの以前の測定によれば、多くの機能的突然変異はこれらの機能的特性にほとんどまたはまったく影響を与えません (7 ) (図 1、A および B は ACE2 親和性の喪失を示し、図 S2 は RBD 発現の減少を示します。
(A) REGN-COV2 内の抗体のマッピング。左側の折れ線グラフは、RBD の各部位でのエスケープ (各部位のすべての変異の合計) を示しています。右のロゴ画像は強力な脱出場所（紫色の下線）を示しています。各文字の高さはアミノ酸変異によって媒介されるエスケープの強度に比例し、各変異の「エスケープ スコア」1 は完全なエスケープに対応します。y 軸のスケールは行ごとに異なるため、たとえば、E406W はすべての REGN 抗体を回避しますが、カクテルの場合は個々の抗体の他の回避サイトに圧倒されるため、これが最も明白です。スケーラブル バージョンでは、S2、A、B を使用して、突然変異が折り畳まれた RBD の発現にどのような影響を与えるかによってマップを色分けします。S2、C、および D は、循環ウイルス分離株で観察されるすべての変異間で ACE2 親和性と RBD 発現への影響を分配するために使用されます。(B) (A) に示すように、LY-CoV016 を描画します。(C) スパイクシュードタイプ化レンチウイルス粒子を使用して、中和アッセイで重要な変異を検証します。私たちは、循環中の SARS-CoV-2 分離株 (N439K など) において、より大きな影響を与える、または高頻度で存在すると予測される変異を検証することを選択しました。各点は、D614G を含む非変異野生型 (WT) のピークに対する変異の阻害濃度中央値 (IC50) の増加倍数を表します。青い破線 1 は WT と同様の中和効果を示し、値 > 1 は中和抵抗の増加を示します。ドットの色は、マップから脱出するかどうかを示します。ドットは、IC50 が使用される希釈系列の範囲外であるため、複数の変更がチェックされる (上限または下限) ことを示します。ほとんどの変異体は二重にテストされるため、ポイントは 2 つあります。完全な中和曲線を図 2 に示します。 S3。アミノ酸残基の一文字略号は以下のとおりである。A、Ala；C、システイン。D、Asp;E、グルタミン酸。F、フェ。G、グリ。H、彼の。私、イル。K、リジン;L、リュー。メトロポリス N、アッセン;P、プロ。Q、グレン。R、引数;S、サー;T、Th;V、ヴァル。W、トリプトファン。そしてY、Tyr。
重要な変異の抗原効果を検証するために、穂偽型レンチウイルス粒子を使用して中和アッセイを実行したところ、抗体結合エスケープマップと中和アッセイの間に一貫性があることがわかりました（図1Cおよび図S3）。REGN-COV2 抗体マップから予想されるように、位置 486 の変異は REGN10933 によってのみ中和され、位置 439 および 444 の変異は REGN10987 によってのみ中和されるため、これらの変異は回避できません。しかし、E406W は 2 つの REGN-COV2 抗体を回避したため、混合物からも強力に回避しました。Regeneron は、構造分析とウイルス エスケープ選択を通じて、単一のアミノ酸変異がカクテル中の 2 つの抗体から逃れることはできないと考えています (11、12)。しかし、我々の完全なマップでは、E406W がカクテル エスケープ変異であることが特定されています。E406W は、比較的特異的な方法で REGN-COV2 抗体に影響を及ぼし、LY-CoV016 の中和効果 (図 1C) とスパイクされたシュードタイプ レンチウイルス粒子の力価 (図 1C) をわずかに低下させるだけであるため、RBD の機能に深刻な干渉を与えません。 S3F）。
私たちのエスケープマップが抗体選択下でのウイルスの進化と一致するかどうかを調べるために、最初にRegeneronウイルスエスケープ選択実験のデータをチェックしました。この実験では、発現スパイクはREGN10933小胞体の存在下で細胞培養で増殖しました。口内炎ウイルス (VSV)、REGN10987 または REGN-COV2 カクテル (12)。この研究により、REGN10933 から 5 つのエスケープ変異、REGN10987 から 2 つのエスケープ変異が同定されましたが、カクテルからの変異は同定されませんでした (図 2A)。7 つの細胞培養すべてで選択された変異はエスケープ マップで強調表示されており、Wuhan-Hu-1 RBD 配列の野生型コドンの一塩基変化もアクセス可能であり (図 2B)、エスケープ一致間の違いを示しています。細胞培養における抗体圧力下でのウイルス進化のグラフ。E406W は単一ヌクレオチドの変化によってアクセスできないことは注目に値します。これが、RBD フォールディングおよび ACE2 親和性の耐性が比較的良好であるにもかかわらず、Regeneron カクテル選択で E406W を識別できない理由を説明している可能性があります。
(A) 抗体の存在下で、Regeneron は穂偽型 VSV を使用して、細胞培養におけるウイルスエスケープ変異を選択します (12)。(B) 図 1A に示すエスケープ ダイアグラムですが、Wuhan-Hu-1 配列内の単一ヌクレオチドの変更によってアクセス可能な変異のみを示しています。灰色以外は細胞培養における突然変異 (赤)、感染患者 (青)、またはその両方 (紫) を示します。図S5はこれらのグラフを示しており、変異がACE2親和性またはRBD発現にどのように影響するかによって色分けされています。(C) 感染145日目にREGN-COV2で治療された患者におけるRBD変異の動態(黒い点線の縦線)。E484A と F486I 間の連鎖の頻度は増加しましたが、この図では E484A がエスケープ変異ではないため、他のパネルには示されていません。図も参照してください。S4.(D) 細胞培養および感染患者で発生するエスケープ変異には単一のヌクレオチドによってアクセス可能であり、エスケープ抗体の結合によって ACE2 親和性が大幅に低下することはありません [酵母ディスプレイ法 (7) で測定した場合]。各点は突然変異であり、その形状と色は、ウイルスの増殖中にアクセスして選択できるかどうかを示します。X 軸の右側の点が多いほど、より強力な抗体結合回避を示します。y 軸上の点が高いほど、ACE2 親和性が高いことを示します。
Escape Atlas がヒトに感染するウイルスの進化を分析できるかどうかを判断するために、私たちは、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) 治療の診断後 145 日目に REGN-COV2 を受けた持続感染免疫不全患者のディープ シークエンシング データを調べました (16)。治療が遅れると、患者のウイルス集団に遺伝的多様性が蓄積されますが、その一部は免疫ストレスによって引き起こされる可能性があります。これは、治療前に患者の自己中和抗体反応が弱いためです(16)。REGN-COV2 の投与後、RBD における 5 つのアミノ酸変異の頻度は急速に変化しました (図 2C および図 S4)。我々のエスケープマップは、これらの変異のうち 3 つが REGN10933 からエスケープし、1 つが REGN10987 からエスケープしたことを示しました (図 2B)。抗体処理後、すべての突然変異が固定部位に移されたわけではないことは注目に値します。それどころか、競争の盛衰が起こります (図 2C)。このパターンは他のウイルスの適応宿主の内部進化でも観察されており (17、18)、これはおそらく遺伝的ただ乗りとウイルス系統間の競合によるものと考えられます。これらの力はどちらも持続感染患者において役割を果たしているようです (図 2C および図 S4C): E484A (この図ではエスケープ変異ではありません) と F486I (エスケープ REGN10933) が治療後にただ乗りし、N440D を保有するウイルス系統Q493K (それぞれ REGN10987 および REGN10933 をエスケープ) は、まず REGN10933 エスケープ変異体 Y489H と競合し、次に E484A および F486I を保有する系統および Q493K と競合しました。
REGN-COV2 で治療された患者における 4 つのエスケープ変異のうち 3 つは、Regeneron のウイルス細胞培養選択では同定されませんでした (図 2B)。これは、完全なマップの利点を示しています。ウイルスの選択は、特定の細胞培養実験でランダムに選択された変異しか識別できないため、不完全です。それどころか、完全なマップではすべての変異に注釈が付けられます。これには、治療とは関係のない理由によって引き起こされた、誤って抗体結合に影響を与えた変異も含まれる可能性があります。
もちろん、ウイルスの進化は機能の制限や抗体を回避する圧力の影響を受けます。細胞培養で選択された変異と患者は、常に次の基準を満たします。抗体結合を回避し、単一ヌクレオチドの変化によって侵入することができ、ACE2 親和性に対するコストがほとんどまたはまったくありません [酵母スキャン測定 RBD (7 を使用して表示された以前の深い変異による) )] (図 2D および図 S5)。したがって、突然変異が RBD の重要な生化学的表現型 (ACE や抗体結合など) にどのような影響を与えるかの完全なマップを使用して、ウイルス進化の考えられる経路を評価することができます。1 つの注意点は、ウイルス免疫や薬物回避で観察されるように、進化の時間枠が長くなると、エピスタティック相互作用により、突然変異の許容範囲が変化する可能性があることです (19-21)。
完全なマップにより、循環している SARS-CoV-2 に存在するエスケープ変異を評価することができます。2021年1月11日の時点で利用可能なヒト由来のSARS-CoV-2配列をすべてチェックしたところ、多数のRBD変異が1つ以上の抗体から逃れていることが判明した（図3）。しかし、配列の 0.1% 以上に存在する唯一のエスケープ変異は REGN10933 エスケープ変異体 Y453F [配列の 0.3%。(12) を参照]、REGN10987 エスケープ変異体 N439K [配列の 1.7%;図 1C および (22) を参照]、LY-CoV016 エスケープ変異 K417N (0.1% 配列、図 1C も参照)。Y453F は、オランダとデンマークのミンク農場に関連した独立した発生と関連しています (23、24)。ミンク配列自体が F486L (24) などの他のエスケープ変異を含む場合があることは注目に値します。N439K はヨーロッパで非常に人気があり、ヨーロッパのスコットランドとアイルランドからの配列の大部分を構成しています (22、25)。K417N は、南アフリカで最初に発見された B.1.351 系統に存在します (10)。現在懸念されているもう 1 つの変異は N501Y です。これは B.1.351 に存在し、英国で最初に同定された B.1.1.7 系統にも存在します (9)。私たちのマップは、N501Y が REGN-COV2 抗体には影響を及ぼさないが、LY-CoV016 に対しては中程度の影響しかないことを示しています (図 3)。
2021 年 1 月 11 日時点の GISAID 上の 317,866 個の高品質ヒト由来 SARS-CoV-2 配列のうち、各抗体または抗体の組み合わせについて (26)、各変異のエスケープ スコアとその頻度の関係。マークが付いています。REGN-COV2 カクテルエスケープ変異 E406W は、武漢-Hu-1 RBD 配列内の複数のヌクレオチドの変更を必要としますが、GISAID 配列では観察されません。残基 E406 の他の変異 (E406Q および E406D) は低頻度の計数で観察されましたが、これらの変異アミノ酸は W から遠く離れた一塩基変異ではありません。
予想通り、エスケープ変異は通常、抗体と RBD の界面で発生します。ただし、構造だけでは、どの変異が回避を媒介するかを予測するのに十分ではありません。たとえば、LY-CoV016は重鎖と軽鎖を使用して、ACE2結合表面と重なる幅広いエピトープに結合しますが、回避プロセスには重鎖相補性決定領域のRBD残基の変異が含まれます（図4Aおよび図S6、EからG)。対照的に、REGN10933 および REGN10987 からのエスケープは主に、抗体の重鎖と軽鎖の界面に積み重ねられた RBD 残基で発生しました (図 4A および図 S6、A ～ D)。REGN-COV2 混合物から逃れた E406W 変異は、どちらの抗体とも接触していない残基で発生しました (図 4、A および B)。E406 は構造的に LY-CoV016 に近いですが (図 4B および図 S6H)、E406W 変異が抗体に及ぼす影響ははるかに小さく (図 1、B、および C)、これは特定の長距離構造メカニズムが抗 REGN であることを示しています。 - COV2 抗体 (図 S6I)。要約すると、抗体と接触している RBD 残基での変異は常にエスケープを媒介するとは限らず、いくつかの重要なエスケープ変異は抗体と接触していない残基で発生します (図 4B および図 S6、D および G)。
(A) 抗体が結合した RBD 構造に投影されたエスケープ ダイアグラム。[REGN10933 および REGN10987: タンパク質データベース (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)]。抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインは青色の漫画として示されており、RBD の表面の色は、この部位での変異媒介エスケープの強さを示します (白はエスケープがないことを示し、赤色は最も強いことを示します)抗体または混合物のエスケープサイト）。機能的に変異していないサイトはグレー表示されます。(B) 各抗体について、その部位を抗体の直接接触 (抗体の 4 Å 以内の非水素原子)、近位抗体 (4 ～ 8 Å)、または遠位抗体 (> 8 Å) として分類します。各点はサイトを表し、エスケープ (赤) または非エスケープ (黒) に分けられます。灰色の破線は、サイトを脱出または非脱出として分類するために使用される臨界値を表します (詳細については、「材料と方法」を参照)。赤と黒の数字は、各カテゴリでエスケープまたはエスケープされないサイトの数を示します。
この研究では、3 つの主要な抗 SARS-CoV-2 抗体を回避する変異を完全にマッピングしました。これらのマップは、エスケープ変異のこれまでの特徴付けが不完全であることを示しています。REGN-COV2 カクテルに含まれる 2 つの抗体を回避できる単一アミノ酸変異はいずれも特定されておらず、カクテルで治療された持続感染患者の大部分も特定されていません。突然変異。もちろん、私たちのマップは、SARS-CoV-2 がこれらの抗体に対して広範な耐性を獲得するだろうかという最も差し迫った質問にまだ答えていません。しかし確かなことは、非常に多くのエスケープ変異がRBDのフォールディングや受容体親和性にほとんど影響を及ぼさず、流行しているウイルスにはすでにいくつかの低レベルの変異が存在することが懸念されるということである。結局のところ、SARS-CoV-2が集団内に広がる際にどのような変異が伝染するのかを待って観察する必要がある。私たちの研究は、ウイルスゲノム監視によって分類された変異の影響を即座に説明することで「観察」に役立ちます。
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タイラー N. スター、アリソン J. グリーニー、アミン アデティア、ウィリアム W. ハノン、マニッシュ C. チョーダリー (マニッシュ C. チョーダリー)、アダム S. ディンジス (アダム S.
Regeneron モノクローナル抗体混合物から逃れる SARS-CoV-2 変異の完全なマップは、患者の治療におけるウイルスの進化を説明するのに役立ちます。
タイラー N. スター、アリソン J. グリーニー、アミン アデティア、ウィリアム W. ハノン、マニッシュ C. チョーダリー (マニッシュ C. チョーダリー)、アダム S. ディンジス (アダム S.
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投稿時間: 2021 年 2 月 24 日