몇몇 항체는 이미 코로나19 치료를 위한 치료법으로 사용 중이거나 개발 중에 있습니다.중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)의 새로운 변종의 출현으로 이들이 여전히 항체 치료에 취약할지 여부를 예측하는 것이 중요합니다.Starret al.숙주 수용체(ACE2)에 대한 결합을 크게 방해하지 않는 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인의 모든 돌연변이를 포괄하고 이러한 돌연변이가 세 가지 주요 항SARS-CoV 도메인에 어떤 영향을 미치는지 매핑하는 효모 라이브러리가 사용되었습니다. -2 항체 결합.이 그림은 Regeneron 항체 혼합물에서 두 항체를 탈출하는 단일 돌연변이를 포함하여 항체 결합을 탈출하는 돌연변이를 식별합니다.단일 항체를 벗어나는 많은 돌연변이가 인간에게 퍼지고 있습니다.
항체는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 치료를 위한 잠재적인 치료법이지만, 바이러스가 위험을 피하기 위해 발전하는지는 확실하지 않습니다.여기에서는 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(RBD)의 모든 돌연변이가 REGN-COV2 칵테일과 항체 LY-CoV016의 결합에 어떻게 영향을 미치는지 매핑합니다.이 완전한 지도는 서로 다른 구조적 에피토프를 표적으로 하는 두 개의 항체 REGN10933 및 REGN10987로 구성된 REGN-COV2 혼합물을 완전히 회피하는 아미노산 돌연변이를 보여주었습니다.이 수치는 또한 REGN-COV2로 치료받은 지속적으로 감염된 환자와 시험관 내 바이러스 탈출 선택 중에 선택된 바이러스 돌연변이를 식별합니다.마지막으로, 이 수치는 단일 항체를 탈출하는 돌연변이가 순환하는 SARS-CoV-2 변종에 이미 존재한다는 것을 보여줍니다.이러한 완전한 탈출 지도는 바이러스 감시 중에 관찰된 돌연변이의 결과를 설명할 수 있습니다.
중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)를 치료하기 위한 항체가 개발되고 있습니다(1).특정 다른 바이러스에 대한 항체는 감염된 환자의 치료 중에 선택된 바이러스 돌연변이(2, 3) 또는 전체 바이러스 계열에 저항성을 부여하기 위해 전 세계적으로 퍼진 바이러스 돌연변이에 의해 효과가 없게 될 수 있습니다.따라서 바이러스 감시 중에 관찰된 돌연변이가 항체 치료의 효과에 어떤 영향을 미치는지 평가하려면 어떤 SARS-CoV-2 돌연변이가 주요 항체를 벗어날 수 있는지 결정하는 것이 중요합니다.
대부분의 주요 항-SARS-CoV-2 항체는 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2) 수용체에 대한 결합을 매개하는 바이러스 수용체 결합 도메인(RBD)을 표적으로 합니다(5, 6).최근에 우리는 RBD의 모든 돌연변이가 항바이러스 항체의 기능과 인식에 어떻게 영향을 미치는지 파악하기 위한 심층 돌연변이 스캐닝 방법을 개발했습니다(7, 8).이 방법에는 RBD 돌연변이체 라이브러리를 생성하고, 이를 효모 표면에 발현시키고, 형광 활성화 세포 분류 및 심층 시퀀싱을 사용하여 각 돌연변이가 RBD 접힘, ACE2 친화성(적정 시리즈에서 측정) 및 항체 결합에 어떻게 영향을 미치는지 정량화하는 작업이 포함됩니다. (그림 S1A).이 연구에서 우리는 (7)에 설명된 반복 돌연변이 라이브러리를 사용했는데, 이는 3819개의 가능한 아미노산 돌연변이 중 3804개를 포괄하는 바코드 RBD 변이체로 구성되어 있습니다.우리 라이브러리는 초기 분리된 Wuhan-Hu-1의 RBD 유전적 배경을 바탕으로 준비되었습니다.여러 돌연변이의 빈도가 증가하고 있지만 여전히 가장 일반적인 RBD 서열을 나타냅니다(9, 10).우리는 RBD 접힘 및 ACE 결합을 강력하게 방해하지 않는 2034개 돌연변이 중 2개(7) REGN-COV2 칵테일(REGN10933 및 REGN10987)(11, 12)을 전달하는 방법과 Eli Lilly의 LY-CoV016의 재조합 형태를 그렸습니다. 항체는 항체(CB6 또는 JS016이라고도 함) 결합 방법에 영향을 미칩니다(13)(그림 S1B).REGN-COV2는 최근 COVID-19에 대한 긴급 사용 승인을 받았고(14), LY-CoV016은 현재 3상 임상 시험을 진행 중입니다(15).
[Glu406→Trp(E406W)]는 두 항체의 혼합물을 강력하게 탈출했습니다(그림 1A).LY-CoV016의 탈출 지도에서는 RBD의 여러 부위에서 많은 탈출 돌연변이가 발견되었습니다(그림 1B).일부 탈출 돌연변이는 RBD가 ACE2에 결합하거나 적절하게 접힌 형태로 발현하는 능력을 손상시킬 수 있지만, 효모 표시 RBD를 사용한 심층 돌연변이 스캐닝의 이전 측정에 따르면 많은 기능적 돌연변이는 이러한 기능적 특성에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않습니다. ) (그림 1, A 및 B는 ACE2 친화력의 손실을 나타내고 그림 S2는 RBD 발현의 감소를 나타냅니다.
(A) REGN-COV2의 항체 매핑.왼쪽의 선 그래프는 RBD의 각 부위에서의 탈출을 보여줍니다(각 부위의 모든 돌연변이의 합계).오른쪽 로고 이미지는 강한 탈출 위치(보라색 밑줄)를 나타냅니다.각 문자의 높이는 아미노산 돌연변이에 의해 매개되는 탈출 강도에 비례하며, 각 돌연변이에 대한 "탈출 점수" 1은 완전한 탈출에 해당합니다.y축 스케일은 행마다 다르므로 예를 들어 E406W는 모든 REGN 항체를 탈출하지만 개별 항체의 다른 탈출 사이트에 의해 압도되기 때문에 칵테일의 경우 가장 분명합니다.확장 가능한 버전의 경우 S2, A 및 B는 돌연변이가 접힌 RBD의 표현에 어떻게 영향을 미치는지 지도에 색상을 지정하는 데 사용됩니다.S2, C 및 D는 순환하는 바이러스 분리주에서 관찰된 모든 돌연변이 사이에서 ACE2 친화도 및 RBD 발현에 대한 영향을 분배하는 데 사용됩니다.(B) (A)와 같이 LY-CoV016을 그립니다.(C) 스파이크 유사형 렌티바이러스 입자를 사용하여 중화 분석에서 주요 돌연변이를 확인합니다.우리는 순환계에서 SARS-CoV-2 분리주(예: N439K)에 더 큰 영향을 미치거나 높은 빈도로 존재할 것으로 예측되는 돌연변이를 확인하기로 결정했습니다.각 점은 D614G를 함유하는 돌연변이되지 않은 야생형(WT)의 피크에 비해 돌연변이의 중간 억제 농도(IC50)의 배수 증가를 나타냅니다.파란색 점선 1은 WT와 유사한 중화 효과를 나타내고, 값 > 1은 증가된 중화 저항을 나타냅니다.점의 색상은 지도에서 탈출할지 여부를 나타냅니다.점은 IC50이 사용된 희석 계열을 벗어났기 때문에 다중 변경이 확인되었음을 나타냅니다(상한 또는 하한).대부분의 돌연변이는 이중으로 테스트되므로 두 가지 점이 있습니다.완전한 중화 곡선은 그림 2에 나와 있습니다. S3.아미노산 잔기의 한 글자 약어는 다음과 같습니다: A, Ala;C, 시스테인;D, Asp;E, 글루;F, 페;G, 글리;H, 그의;나, 일;K, 라이신;엘, 리우;메트로폴리스 N, 아센;P, 프로;Q, Gln;R, Arg;S, 세르;T, Thr;V, 발;W, 트립토판;그리고 Y, 티르.
주요 돌연변이의 항원 효과를 확인하기 위해 원추형 슈도타입 렌티바이러스 입자를 사용하여 중화 분석을 수행했으며 항체 결합 탈출 맵과 중화 분석 사이에 일관성이 있음을 발견했습니다(그림 1C 및 그림 S3).REGN-COV2 항체 지도에서 예상한 대로 486번 위치의 돌연변이는 REGN10933에 의해서만 중화되는 반면, 439번과 444번 위치의 돌연변이는 REGN10987에 의해서만 중화되므로 이러한 돌연변이는 탈출할 수 없습니다.하지만 E406W는 두 개의 REGN-COV2 항체를 탈출했기 때문에 혼합물에서도 강력하게 탈출했습니다.구조 분석 및 바이러스 탈출 선택을 통해 Regeneron은 단일 아미노산 돌연변이가 칵테일의 두 항체를 탈출할 수 없다고 믿지만(11, 12), 우리의 전체 지도에서는 E406W를 칵테일 탈출 돌연변이로 식별합니다.E406W는 상대적으로 특정한 방식으로 REGN-COV2 항체에 영향을 미치며, LY-CoV016의 중화 효과(그림 1C)와 스파이크된 슈도타입 렌티바이러스 입자의 역가를 약간만 감소시키기 때문에 RBD의 기능을 심각하게 방해하지 않습니다(그림 S3F).
우리의 탈출 맵이 항체 선택 하에서 바이러스의 진화와 일치하는지 여부를 조사하기 위해 먼저 Regeneron 바이러스 탈출 선택 실험의 데이터를 확인했습니다. 여기서 발현 스파이크는 REGN10933 존재 하의 세포 배양에서 성장했습니다. 구내염 바이러스(VSV), REGN10987 또는 REGN-COV2 칵테일(12).이 연구에서는 REGN10933에서 5개의 탈출 돌연변이, REGN10987에서 2개의 탈출 돌연변이, 칵테일에서는 돌연변이가 없음을 확인했습니다(그림 2A).7개 세포 배양 모두에 의해 선택된 돌연변이는 탈출 맵에서 강조 표시되며, 무한-Hu-1 RBD 서열에서 야생형 코돈의 단일 뉴클레오티드 변화도 접근 가능합니다(그림 2B). 이는 탈출 간의 차이를 나타냅니다. 세포 배양의 항체 압력 하에서의 그래프 및 바이러스 진화.E406W는 단일 뉴클레오티드 변화로 접근할 수 없다는 점은 주목할 가치가 있으며, 이는 Regeneron 칵테일 선택이 RBD 접힘 및 ACE2 친화성에 대한 상대적으로 우수한 내성에도 불구하고 E406W를 식별할 수 없는 이유를 설명할 수 있습니다.
(A) 항체가 있는 경우 Regeneron은 원추형 유사형 VSV를 사용하여 세포 배양에서 바이러스 탈출 돌연변이를 선택합니다(12).(B) 탈출 다이어그램은 그림 1A에 표시되어 있지만 우한-Hu-1 서열의 단일 뉴클레오티드 변화에 의해 접근 가능한 돌연변이만 보여줍니다.회색이 아닌 것은 세포 배양(빨간색), 감염된 환자(파란색) 또는 둘 다(보라색)의 돌연변이를 나타냅니다.그림 S5는 돌연변이가 ACE2 친화성 또는 RBD 발현에 미치는 영향에 따라 색상이 지정된 그래프를 보여줍니다.(C) 감염 145일째에 REGN-COV2로 치료받은 환자의 RBD 돌연변이 동역학(검은색 점선 수직선).E484A와 F486I 사이의 연결 빈도가 증가했지만 E484A는 그림에서 탈출 돌연변이가 아니기 때문에 다른 패널에는 표시되지 않습니다.그림도 참조하세요.S4.(D) 세포 배양 및 감염된 환자에서 발생하는 탈출 돌연변이는 단일 뉴클레오티드로 접근 가능하며 탈출 항체의 결합은 ACE2 친화도에 큰 비용을 발생시키지 않습니다[효모 디스플레이 방법(7)으로 측정).각 지점은 돌연변이이며, 그 모양과 색상은 바이러스 성장 중에 접근하고 선택할 수 있는지 여부를 나타냅니다.x축의 오른쪽 지점이 많을수록 항체 결합 탈출이 더 강해짐을 나타냅니다.y축의 점이 높을수록 ACE2 선호도가 더 높다는 것을 나타냅니다.
Escape Atlas가 인간을 감염시키는 바이러스의 진화를 분석할 수 있는지 확인하기 위해, 코로나19 치료 진단 후 145일째에 REGN-COV2를 투여받은 지속 감염 면역 저하 환자의 심층 시퀀싱 데이터를 조사했습니다(16).치료가 늦어지면 환자의 바이러스 집단이 유전적 다양성을 축적할 수 있으며, 그 중 일부는 치료 전에 환자의 자가중화 항체 반응이 약하기 때문에 면역 스트레스에 의해 유발될 수 있습니다(16).REGN-COV2 투여 후 RBD의 5개 아미노산 돌연변이 빈도는 빠르게 변했습니다(그림 2C 및 그림 S4).우리의 탈출 지도는 이러한 돌연변이 중 3개가 REGN10933을 탈출하고 1개가 REGN10987을 탈출했음을 보여주었습니다(그림 2B).항체 치료 후에 모든 돌연변이가 고정된 부위로 옮겨지는 것은 아니라는 점은 주목할 가치가 있습니다.반대로 경쟁의 상승과 하락이 있습니다(그림 2C).이 패턴은 다른 바이러스의 적응 숙주의 내부 진화에서 관찰되었는데(17, 18), 아마도 유전적 무임승차와 바이러스 계통 간의 경쟁 때문일 것입니다.이 두 힘 모두 지속적인 감염 환자에서 역할을 하는 것으로 보입니다(그림 2C 및 그림 S4C): E484A(우리 다이어그램에서는 탈출 돌연변이가 아님) 및 F486I(탈출 REGN10933) 치료 후 무임승차, 그리고 N440D를 보유하는 바이러스 계통 Q493K(각각 REGN10987 및 REGN10933을 탈출)는 먼저 REGN10933 탈출 돌연변이 Y489H와 경쟁한 다음 E484A, F486I 및 Q493K를 보유하는 계통과 경쟁했습니다.
REGN-COV2로 치료받은 환자의 탈출 돌연변이 4개 중 3개는 Regeneron의 바이러스 세포 배양 선택에서 확인되지 않았으며(그림 2B), 이는 전체 지도의 장점을 보여줍니다.바이러스 선택은 특정 세포 배양 실험에서 무작위로 선택된 돌연변이만 식별할 수 있기 때문에 불완전합니다.반대로, 전체 지도에는 모든 돌연변이에 대한 주석이 표시됩니다. 여기에는 치료와 관련이 없는 이유로 발생한 돌연변이가 포함될 수 있지만 우연히 항체 결합에 영향을 미칠 수 있습니다.
물론, 바이러스의 진화는 기능적 한계와 항체를 회피하려는 압력에 의해 영향을 받습니다.세포 배양에서 선택된 돌연변이와 환자는 항상 다음 기준을 충족합니다. 그들은 항체 결합을 피하고, 단일 뉴클레오티드 변화를 통해 들어갈 수 있으며, ACE2 친화력에 대한 비용이 거의 또는 전혀 없습니다[효모 스캐닝 측정 RBD를 사용하여 표시된 이전의 깊은 돌연변이를 통해(7 )] (그림 2D 및 그림 S5).따라서 돌연변이가 RBD의 주요 생화학적 표현형(예: ACE 및 항체 결합)에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 완전한 지도를 사용하여 바이러스 진화의 가능한 경로를 평가할 수 있습니다.한 가지 주의할 점은 바이러스 면역 및 약물 탈출에서 관찰되는 것처럼 더 긴 진화 기간에서는 상위성 상호작용으로 인해 돌연변이에 대한 내성 공간이 변경될 수 있다는 것입니다(19-21).
전체 지도를 통해 우리는 순환하는 SARS-CoV-2의 기존 탈출 돌연변이를 평가할 수 있습니다.우리는 2021년 1월 11일 현재 사용 가능한 모든 인간 유래 SARS-CoV-2 서열을 확인한 결과 다수의 RBD 돌연변이가 하나 이상의 항체에서 빠져나오는 것을 발견했습니다(그림 3).그러나 서열의 >0.1%에 존재하는 유일한 탈출 돌연변이는 REGN10933 탈출 돌연변이 Y453F[서열의 0.3%;(12) 참조], REGN10987 탈출 돌연변이 N439K [서열의 1.7%;그림 1C 및 (22) 참조] 및 LY-CoV016 탈출 돌연변이 K417N(0.1% 서열; 그림 1C도 참조).Y453F는 네덜란드 및 덴마크의 밍크 농장과 관련된 독립적인 발병과 관련이 있습니다(23, 24).밍크 서열 자체가 때때로 F486L과 같은 다른 탈출 돌연변이를 포함한다는 점은 주목할 가치가 있습니다(24).N439K는 유럽에서 매우 인기가 높으며 유럽의 스코틀랜드와 아일랜드 서열의 큰 부분을 구성합니다(22, 25).K417N은 남아프리카에서 처음 발견된 B.1.351 계통에 존재합니다(10).현재 우려되는 또 다른 돌연변이는 B.1.351과 영국에서 원래 확인된 B.1.1.7 계통에도 존재하는 N501Y입니다(9).우리 지도는 N501Y가 REGN-COV2 항체에는 효과가 없지만 LY-CoV016에는 중간 정도의 효과만 있음을 보여줍니다(그림 3).
2021년 1월 11일 현재 GISAID(26)에 있는 317,866개의 고품질 인간 유래 SARS-CoV-2 서열 중 각 항체 또는 항체 조합에 대해 각 돌연변이에 대한 탈출 점수와 빈도 간의 관계가 확인되었습니다.표시되어 있습니다.REGN-COV2 칵테일 탈출 돌연변이 E406W는 무한-Hu-1 RBD 서열에서 다중 뉴클레오티드 변화를 요구하며 GISAID 서열에서는 관찰되지 않습니다.잔기 E406의 다른 돌연변이(E406Q 및 E406D)가 낮은 빈도 계수로 관찰되었지만 이러한 돌연변이 아미노산은 W에서 멀리 떨어진 단일 뉴클레오티드 돌연변이가 아닙니다.
예상한 대로 탈출 돌연변이는 일반적으로 항체-RBD 경계면에서 발생합니다.그러나 구조만으로는 어떤 돌연변이가 탈출을 중재하는지 예측하는 데 충분하지 않습니다.예를 들어, LY-CoV016은 중쇄와 경쇄를 사용하여 ACE2 결합 표면과 겹치는 넓은 에피토프에 결합하지만 탈출 과정에는 중쇄 상보성 결정 영역의 RBD 잔기 돌연변이가 포함됩니다(그림 4A 및 그림 S6, E ~ G).대조적으로, REGN10933 및 REGN10987로부터의 이탈은 주로 항체 중쇄 및 경쇄의 경계면에 쌓인 RBD 잔기에서 발생했습니다(그림 4A 및 그림 S6, A~D).REGN-COV2 혼합물을 탈출한 E406W 돌연변이는 어느 항체와도 접촉하지 않은 잔기에서 발생했습니다(그림 4, A 및 B).E406은 구조적으로 LY-CoV016에 더 가깝지만(그림 4B 및 그림 S6H), E406W 돌연변이는 항체에 훨씬 작은 영향을 미치며(그림 1, B 및 C), 이는 특정 장거리 구조 메커니즘이 항REGN임을 나타냅니다. - COV2 항체(그림 S6I).요약하면, 항체와 접촉하는 RBD 잔기의 돌연변이가 항상 탈출을 중재하는 것은 아니며 일부 중요한 탈출 돌연변이는 항체와 접촉하지 않는 잔기에서 발생합니다(그림 4B 및 그림 S6, D 및 G).
(A)항체에 의해 결합된 RBD 구조에 투영된 탈출 다이어그램.[REGN10933 및 REGN10987: 단백질 데이터베이스(PDB) ID 6XDG(11);LY-CoV016: PDB ID 7C01(13)].항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인은 파란색 만화로 표시되며, RBD 표면의 색상은 이 부위에서 돌연변이 매개 탈출의 강도를 나타냅니다(흰색은 탈출이 없음을 나타내고 빨간색은 가장 강한 것을 나타냄). 항체 또는 혼합물의 탈출 부위).기능적으로 변형되지 않은 사이트는 회색으로 표시됩니다.(B) 각 항체에 대해 부위를 직접 항체 접촉(항체의 4Å 내의 비수소 원자), 근위 항체(4~8Å) 또는 원위 항체(> 8Å)로 분류합니다.각 점은 탈출(빨간색) 또는 비탈출(검은색)으로 구분된 사이트를 나타냅니다.회색 점선은 해당 사이트를 탈출 또는 비탈출로 분류하는 데 사용되는 임계 값을 나타냅니다(자세한 내용은 재료 및 방법 참조).빨간색과 검은색 숫자는 각 범주에서 이스케이프되거나 이스케이프되지 않은 사이트 수를 나타냅니다.
이 연구에서 우리는 세 가지 주요 항-SARS-CoV-2 항체를 회피하는 돌연변이를 완전히 매핑했습니다.이 지도는 탈출 돌연변이의 이전 특성화가 불완전함을 나타냅니다.REGN-COV2 칵테일의 두 항체를 빠져나갈 수 있는 단일 아미노산 돌연변이는 확인되지 않았으며, 이 칵테일로 치료받은 지속 감염 환자의 대다수도 확인되지 않았습니다.돌연변이.물론 우리 지도는 아직 가장 시급한 질문인 SARS-CoV-2가 이러한 항체에 대해 광범위한 저항성을 갖게 될까요?에 대한 답을 제시하지 못했습니다.그러나 확실한 것은 너무 많은 탈출 돌연변이가 RBD 접힘이나 수용체 친화력에 거의 영향을 미치지 않으며 순환하는 바이러스에 이미 낮은 수준의 돌연변이가 있다는 것이 걱정된다는 것입니다.결국, SARS-CoV-2가 인구 사이에 퍼질 때 어떤 돌연변이를 전염시킬지 지켜볼 필요가 있습니다.우리의 작업은 바이러스 게놈 감시로 분류된 돌연변이의 영향을 즉시 설명함으로써 '관찰'에 도움이 될 것입니다.
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Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary(Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges(Adam S.
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게시 시간: 2021년 2월 24일