Kai kurie antikūnai jau naudojami arba kuriami kaip COVID-19 gydymo būdai.Atsiradus naujiems sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV-2) variantams, svarbu numatyti, ar jie vis dar bus jautrūs antikūnų terapijai.Starr ir kt.Naudota mielių biblioteka, apimanti visas SARS-CoV-2 receptorių surišimo domeno mutacijas, kurios stipriai netrikdys prisijungimo prie šeimininko receptoriaus (ACE2), ir nubrėžia, kaip šios mutacijos veikia tris pagrindinius anti-SARS-CoV. -2 antikūnų surišimas.Šie skaičiai identifikuoja mutacijas, kurios išvengia antikūnų prisijungimo, įskaitant pavienes mutacijas, kurios išvengia dviejų antikūnų Regeneron antikūnų mišinyje.Daugelis mutacijų, kurios išvengia vieno antikūno, plinta žmonėms.
Antikūnai yra galimas gydymas sunkiam ūminiam respiracinio sindromo koronavirusui 2 (SARS-CoV-2) gydyti, tačiau nėra aišku, ar virusas vystosi siekiant išvengti rizikos.Čia parodome, kaip visos SARS-CoV-2 receptorių surišimo domeno (RBD) mutacijos veikia REGN-COV2 kokteilio prisijungimą prie antikūno LY-CoV016.Šie išsamūs žemėlapiai atskleidė aminorūgščių mutaciją, kuri visiškai išvengė REGN-COV2 mišinio, kurį sudaro du antikūnai REGN10933 ir REGN10987, nukreipti į skirtingus struktūrinius epitopus.Šie skaičiai taip pat nustato virusų mutacijas, parinktas nuolat užsikrėtusiems pacientams, gydytiems REGN-COV2, ir atrankos metu in vitro viruso pabėgimo metu.Galiausiai šie skaičiai atskleidžia, kad mutacijų, kurios išvengia vieno antikūno, jau yra cirkuliuojančiose SARS-CoV-2 padermėse.Šie išsamūs pabėgimo žemėlapiai gali paaiškinti viruso stebėjimo metu pastebėtų mutacijų pasekmes.
Kuriami antikūnai, skirti gydyti sunkų ūminį kvėpavimo sindromą koronaviruso 2 (SARS-CoV-2) (1).Antikūnai prieš tam tikrus kitus virusus gali būti neveiksmingi dėl virusų mutacijų, parinktų gydant užsikrėtusius pacientus (2, 3), arba virusų mutacijų, kurios išplito visame pasaulyje, kad suteiktų atsparumą visam viruso kladui.Todėl norint įvertinti, kaip viruso stebėjimo metu pastebėtos mutacijos veikia antikūnų terapijos veiksmingumą, labai svarbu nustatyti, kurios SARS-CoV-2 mutacijos gali išvengti pagrindinių antikūnų.
Dauguma pirmaujančių anti-SARS-CoV-2 antikūnų yra nukreipti į viruso receptorių surišimo domeną (RBD), kuris tarpininkauja prisijungimui prie angiotenziną konvertuojančio fermento 2 (ACE2) receptoriaus (5, 6).Neseniai sukūrėme giliųjų mutacijų nuskaitymo metodą, skirtą nustatyti, kaip visos UBR mutacijos veikia jo funkciją ir antivirusinių antikūnų atpažinimą (7, 8).Metodas apima UBR mutantų bibliotekos sukūrimą, jų ekspresiją mielių paviršiuje ir fluorescenciniu būdu aktyvuojamų ląstelių rūšiavimą bei giluminį sekos nustatymą, siekiant kiekybiškai įvertinti, kaip kiekviena mutacija veikia UBR lankstymą, ACE2 afinitetą (matuojama titravimo serijoje) ir antikūnų surišimą. (S1A pav.).Šiame tyrime naudojome pasikartojančią mutantų biblioteką, aprašytą (7), kurią sudaro brūkšniniu kodu pažymėti RBD variantai, apimantys 3804 iš 3819 galimų aminorūgščių mutacijų.Mūsų biblioteka buvo paruošta iš ankstyvojo Wuhan-Hu-1 izoliato UBR genetinio fono.Nors kelių mutantų dažnis didėja, jie vis dar atstovauja dažniausiai pasitaikančioms UBR sekoms (9, 10).Nubrėžėme dvi iš 2034 mutacijų, kurios stipriai nesutrikdo UBR lankstymo ir AKF surišimo (7), kaip perduoti REGN-COV2 kokteilį (REGN10933 ir REGN10987) (11, 12) ir Eli Lilly LY-CoV016 Rekombinantinė forma antikūnas veikia antikūnų (dar vadinamų CB6 arba JS016) surišimo metodą (13) (S1B pav.).REGN-COV2 neseniai buvo suteiktas leidimas naudoti COVID-19 nepaprastosios padėties atveju (14), o LY-CoV016 šiuo metu atliekami 3 fazės klinikiniai tyrimai (15).
[Glu406 → Trp(E406W)] stipriai išvengė dviejų antikūnų mišinio (1A pav.).LY-CoV016 pabėgimo žemėlapis taip pat atskleidė daugybę pabėgimo mutacijų įvairiose UBR vietose (1B pav.).Nors kai kurios pabėgimo mutacijos gali pakenkti UBR gebėjimui prisijungti prie ACE2 arba reikštis tinkamai sulankstyta forma, remiantis ankstesniais giliųjų mutacijų skenavimo matavimais naudojant mielėse rodomą UBR, daugelis funkcinių mutacijų turi nedidelį poveikį šioms funkcinėms savybėms arba jų nedaro (7). ) (1 paveikslas, A ir B rodo ACE2 afiniteto praradimą, o S2 paveikslas rodo UBR ekspresijos sumažėjimą.
(A) REGN-COV2 antikūno kartografavimas.Linijinė diagrama kairėje rodo pabėgimą kiekvienoje UBR vietoje (visų mutacijų kiekvienoje vietoje suma).Dešinėje esančiame logotipo paveikslėlyje parodyta stipri pabėgimo vieta (purpurinis pabraukimas).Kiekvienos raidės aukštis yra proporcingas aminorūgščių mutacijos sukeliamo pabėgimo stiprumui, o kiekvienos mutacijos „pabėgimo balas“ atitinka visišką pabėgimą.Y ašies skalė kiekvienoje eilutėje yra skirtinga, todėl, pavyzdžiui, E406W išvengia visų REGN antikūnų, tačiau tai akivaizdžiausia kokteiliams, nes jį užgožia kitos atskirų antikūnų pabėgimo vietos.Keičiamoje versijoje S2, A ir B naudojami norint nuspalvinti žemėlapį pagal tai, kaip mutacijos veikia sulankstyto UBR išraišką.S2, C ir D naudojami paskirstyti įtaką ACE2 afinitetui ir UBR ekspresijai tarp visų mutacijų, pastebėtų cirkuliuojančių virusų izoliatuose.(B) Kaip parodyta (A), nupieškite LY-CoV016.(C) Norėdami patikrinti pagrindines neutralizacijos tyrimo mutacijas, naudokite pseudotipo lentivirusines daleles.Pasirinkome patikrinti mutacijas, kurios, kaip manoma, turės didesnį poveikį arba dažnai egzistuoja SARS-CoV-2 izoliatuose (pvz., N439K) apyvartoje.Kiekvienas taškas parodo vidutinės slopinančios mutacijos koncentracijos (IC50) padidėjimą, palyginti su nemutuoto laukinio tipo (WT), turinčio D614G, smailės.Mėlyna punktyrinė linija 1 reiškia neutralizacijos efektą, panašų į WT, o vertė > 1 reiškia padidėjusį neutralizavimo pasipriešinimą.Taško spalva rodo, ar norite pabėgti nuo žemėlapio.Taškai rodo, kad kadangi IC50 yra už naudojamos skiedimo serijos ribų, tikrinamas daugkartinis pakeitimas (viršutinė arba apatinė riba).Dauguma mutantų yra tiriami dviem egzemplioriais, todėl yra du taškai.Visa neutralizavimo kreivė parodyta 2 pav. S3.Aminorūgščių liekanų vienos raidės santrumpos yra tokios: A, Ala;C, cisteinas;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, jo;aš, Ilė;K, lizinas;L, Liu;Metropolis N, Asenas;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptofanas;ir Y, Tyr.
Siekdami patikrinti pagrindinių mutacijų antigeninį poveikį, atlikome neutralizacijos testą, naudodami pseudotipines lentivirusines daleles, ir nustatėme, kad antikūnų surišimo pabėgimo žemėlapis ir neutralizacijos tyrimas buvo suderinti (1C pav. ir S3 pav.).Kaip ir tikėtasi iš REGN-COV2 antikūnų žemėlapio, mutaciją 486 padėtyje neutralizuoja tik REGN10933, o mutaciją 439 ir 444 padėtyse neutralizuoja tik REGN10987, todėl šios mutacijos negali pabėgti.Tačiau E406W išvengė dviejų REGN-COV2 antikūnų, todėl jis taip pat stipriai pabėgo nuo mišinio.Atlikdamas struktūrinę analizę ir atrinkdamas virusą, Regeneronas mano, kad jokia aminorūgšties mutacija negali išvengti dviejų kokteilyje esančių antikūnų (11, 12), tačiau mūsų pilnas žemėlapis identifikuoja E406W kaip kokteilio pabėgimo mutaciją.E406W veikia REGN-COV2 antikūną santykinai specifiniu būdu ir rimtai netrukdo UBR funkcijai, nes tik šiek tiek sumažina LY-CoV016 neutralizuojantį poveikį (1C pav.) ir smailių pseudotipo lentivirusinių dalelių titrą ( pav. S3F).
Siekdami išsiaiškinti, ar mūsų pabėgimo žemėlapis atitinka virusų evoliuciją atrenkant antikūnus, pirmiausia patikrinome Regeneron viruso pabėgimo atrankos eksperimento duomenis, kurių metu ekspresijos smaigalys buvo auginamas ląstelių kultūroje, dalyvaujant bet kokiam REGN10933. stomatito virusas (VSV), REGN10987 arba REGN-COV2 kokteilis (12).Šis darbas nustatė penkias pabėgimo mutacijas iš REGN10933, dvi pabėgimo mutacijas iš REGN10987 ir jokių mutacijų iš kokteilio (2A pav.).Visų septynių ląstelių kultūrų pasirinktos mutacijos yra paryškintos mūsų pabėgimo žemėlapyje, o laukinio tipo kodono vieno nukleotido pokytis Wuhan-Hu-1 UBR sekoje taip pat pasiekiamas (2B pav.), nurodantis skirtumą tarp pabėgimų. grafiką ir viruso evoliuciją esant antikūnų slėgiui ląstelių kultūroje.Verta paminėti, kad E406W negalima pasiekti pakeitus vieną nukleotidą, o tai gali paaiškinti, kodėl Regeneron kokteilio pasirinkimas negali jo identifikuoti, nepaisant gana gero UBR lankstymo ir ACE2 afiniteto tolerancijos.
(A) Esant antikūnams, Regeneron naudoja VSV pseudotipą, kad atrinktų viruso pabėgimo mutacijas ląstelių kultūroje (12).(B) Pabėgimo diagrama, kaip parodyta 1A paveiksle, tačiau parodo tik mutacijas, kurias galima pasiekti pakeitus vieną nukleotidą Wuhan-Hu-1 sekoje.Ne pilka spalva rodo ląstelių kultūros mutacijas (raudona) ir infekuotus pacientus (mėlyna) arba abi (violetinė).S5 paveiksle parodytos šios diagramos, nuspalvintos pagal tai, kaip mutacijos veikia ACE2 afinitetą arba UBR ekspresiją.(C) UBR mutacijos kinetika pacientams, gydytiems REGN-COV2 145-ąją infekcijos dieną (juoda punktyrinė vertikali linija).Ryšio tarp E484A ir F486I dažnis padidėjo, tačiau kadangi E484A nėra pabėgimo mutacija mūsų paveiksle, ji nerodoma kitose plokštėse.Taip pat žr. pav.S4.(D) Pabėgimo mutacijos, atsirandančios ląstelių kultūroje ir užsikrėtusiems pacientams, pasiekiamos vienu nukleotidu, o pabėgusių antikūnų surišimas nesukelia didelių išlaidų ACE2 afinitetui [matuojant mielių rodymo metodu (7)].Kiekvienas taškas yra mutacija, o jo forma ir spalva rodo, ar jį galima pasiekti ir pasirinkti viruso augimo metu.Daugiau dešiniųjų taškų x ašyje rodo stipresnį antikūnų surišimą;aukštesni taškai y ašyje rodo didesnį ACE2 afinitetą.
Siekdami nustatyti, ar „Escape Atlas“ gali analizuoti žmones užkrečiančių virusų evoliuciją, ištyrėme gilios sekos duomenis iš nuolat užsikrėtusio paciento, kurio imunitetas susilpnėjęs, 145-ąją dieną po COVID-19 gydymo diagnozės gavusio REGN-COV2 (16).Vėlyvas gydymas leidžia paciento virusų populiacijai kaupti genetinę įvairovę, kurios dalį gali lemti imuninis stresas, nes prieš gydymą pacientas turi silpną autoneutralizuojančių antikūnų atsaką (16).Paskyrus REGN-COV2, penkių aminorūgščių mutacijų dažnis UBR greitai pasikeitė (2C pav. ir S4 pav.).Mūsų pabėgimo žemėlapis parodė, kad trys iš šių mutacijų išvengė REGN10933, o viena – REGN10987 (2B pav.).Verta paminėti, kad po gydymo antikūnais ne visos mutacijos buvo perkeltos į fiksuotą vietą.Priešingai, konkurencija didėja ir mažėja (2C pav.).Šis modelis buvo pastebėtas vidinėje kitų virusų adaptyviųjų šeimininkų evoliucijoje (17, 18), galbūt dėl konkurencijos tarp genetinių laisvalaikio ir virusinių linijų.Atrodo, kad abi šios jėgos vaidina svarbų vaidmenį pacientams, sergantiems nuolatine infekcija (2C pav. ir S4C pav.): E484A (mūsų diagramoje nėra pabėgimo mutacija) ir F486I (pabėgimas REGN10933) po gydymo ir virusų, turinčių N440D ir Q493K (atitinkamai pabėgęs nuo REGN10987 ir REGN10933) pirmiausia konkuravo su REGN10933 pabėgimo mutantu Y489H, o paskui konkuravo su linija, turinčia E484A ir F486I bei Q493K.
Trys iš keturių pabėgimo mutacijų pacientams, gydytiems REGN-COV2, nebuvo nustatytos Regeneron viruso ląstelių kultūros atrankoje (2B pav.), o tai iliustruoja viso žemėlapio pranašumą.Virusų atranka yra neišsami, nes jie gali nustatyti tik bet kokias atsitiktinai parinktas mutacijas tame konkrečiame ląstelių kultūros eksperimente.Priešingai, visas žemėlapis anotuoja visas mutacijas, kurios gali apimti mutacijas, atsiradusias dėl priežasčių, nesusijusių su gydymu, bet netyčia paveikti antikūnų prisijungimą.
Žinoma, virusų evoliucijai įtakos turi funkciniai apribojimai ir spaudimas išvengti antikūnų.Ląstelių kultūroje atrinktos mutacijos ir pacientai visada atitinka šiuos kriterijus: jie išvengia antikūnų prisijungimo, gali patekti pakeitus vieną nukleotidą ir turi mažai arba visai nekainuoja ACE2 afiniteto [per ankstesnes giliąsias mutacijas, parodytas naudojant mielių nuskaitymo matavimo RBD (7) )] (2D pav. ir S5 pav.).Todėl norint įvertinti galimus viruso evoliucijos kelius, galima naudoti išsamų žemėlapį, kaip mutacijos veikia pagrindinius UBR biocheminius fenotipus (pvz., AKF ir antikūnų surišimą).Vienas įspėjimas yra tas, kad ilgesniu evoliucijos laikotarpiu, kaip pastebėta viruso imuniteto ir vaistų pabėgimo atveju, dėl epistatinės sąveikos gali pasikeisti mutacijų tolerancijos erdvė (19–21).
Visas žemėlapis leidžia įvertinti esamas pabėgimo mutacijas cirkuliuojančiame SARS-CoV-2.2021 m. sausio 11 d. patikrinome visas turimas žmogaus gautas SARS-CoV-2 sekas ir nustatėme, kad daugybei UBR mutacijų nepateko vieno ar daugiau antikūnų (3 pav.).Tačiau vienintelė pabėgimo mutacija, esanti >0,1 % sekos, yra REGN10933 pabėgimo mutantas Y453F [0,3 % sekos;žr. (12)], REGN10987 pabėgimo mutantas N439K [1,7 % sekos;žr. 1C ir (22) paveikslus], ir LY-CoV016 išvengia mutacijos K417N (0,1 % seka; taip pat žr. 1C pav.).Y453F yra susijęs su nepriklausomais protrūkiais, susijusiais su audinių ūkiais Nyderlanduose ir Danijoje (23, 24);verta paminėti, kad pačioje audinės sekoje kartais yra kitų pabėgimo mutacijų, tokių kaip F486L (24).N439K yra labai populiarus Europoje ir sudaro didelę Škotijos ir Airijos sekos dalį Europoje (22, 25).K417N egzistuoja B.1.351 giminėje, pirmą kartą atrastoje Pietų Afrikoje (10).Kita šiuo metu susirūpinimą kelianti mutacija yra N501Y, kuri yra B.1.351 ir B.1.1.7 linijoje, kuri iš pradžių buvo nustatyta JK (9).Mūsų žemėlapis rodo, kad N501Y neturi įtakos REGN-COV2 antikūnams, o tik vidutiniškai veikia LY-CoV016 (3 pav.).
2021 m. sausio 11 d. kiekvieno antikūno ar antikūnų derinio iš 317 866 aukštos kokybės žmogaus gautų SARS-CoV-2 sekų GISAID (26) santykis tarp kiekvienos mutacijos pabėgimo balo ir jos dažnio .Jis yra pažymėtas.REGN-COV2 kokteilio pabėgimo mutacijai E406W reikia kelių nukleotidų pakeitimų Wuhan-Hu-1 UBR sekoje ir ji nepastebėta GISAID sekoje.Kitos E406 liekanos mutacijos (E406Q ir E406D) buvo pastebėtos skaičiuojant žemu dažniu, tačiau šios mutantinės aminorūgštys nėra vieno nukleotido mutacijos, toli nuo W.
Kaip ir tikėtasi, pabėgimo mutacijos paprastai atsiranda antikūnų ir RBD sąsajoje.Tačiau vien struktūros nepakanka, kad būtų galima numatyti, kurios mutacijos tarpininkauja pabėgimui.Pavyzdžiui, LY-CoV016 naudoja savo sunkiąsias ir lengvas grandines, kad prisijungtų prie plataus epitopo, kuris sutampa su ACE2 surišimo paviršiumi, tačiau pabėgimo procesas apima UBR liekanų mutacijas sunkiosios grandinės komplementarumą lemiančiame regione (4A pav. ir S6 pav., E. G).Priešingai, ištrūkimai iš REGN10933 ir REGN10987 daugiausia įvyko UBR liekanose, sukrautose antikūnų sunkiųjų ir lengvųjų grandinių sąsajoje (4A pav. ir S6 paveikslas, A–D).E406W mutacija, kuri pabėgo iš REGN-COV2 mišinio, atsirado liekanose, kurios neliečia nei su vienu antikūnu (4 pav., A ir B).Nors E406 yra struktūriškai artimesnis LY-CoV016 (4B ir S6H pav.), E406W mutacija turi daug mažesnį poveikį antikūnui (1, B ir C pav.), o tai rodo, kad specifinis ilgo nuotolio struktūrinis mechanizmas yra anti-REGN. - COV2 antikūnas (S6I pav.).Apibendrinant galima pasakyti, kad UBR liekanų, besiliečiančių su antikūnais, mutacijos ne visada tarpininkauja pabėgimui, o kai kurios reikšmingos pabėgimo mutacijos atsiranda liekanose, kurios nesiliečia su antikūnais (4B pav. ir S6, D ir G pav.).
(A) pabėgimo diagrama, projektuojama ant antikūno surištos UBR struktūros.[REGN10933 ir REGN10987: baltymų duomenų bazės (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PBP ID 7C01 (13)].Sunkiosios ir lengvosios antikūno grandinių kintamieji domenai rodomi kaip mėlynos karikatūros, o UBR paviršiaus spalva rodo mutacijų sukelto pabėgimo šioje vietoje stiprumą (balta reiškia, kad nepabėga, o raudona – stipriausią. antikūno ar mišinio pabėgimo vieta).Svetainės, kurios nėra funkcionaliai mutavusios, yra pilkos spalvos.(B) Kiekvieno antikūno vietą klasifikuokite kaip tiesioginį sąlytį su antikūnu (ne vandenilio atomai 4Å atstumu nuo antikūno), proksimalinį antikūną (4–8Å) arba distalinį antikūną (> 8Å).Kiekvienas taškas reiškia svetainę, padalytą į pabėgimo (raudona) arba nepabėgimo (juoda) dalis.Pilka brūkšninė linija žymi kritinę reikšmę, naudojamą klasifikuojant svetainę kaip pabėgimo arba nepabėgimo (išsamią informaciją žr. Medžiagos ir metodai).Raudoni ir juodi skaičiai rodo, kiek svetainių kiekvienoje kategorijoje yra pašalinta arba nepažeista.
Šiame tyrime mes visiškai suplanavome mutacijas, kurios išvengia trijų pagrindinių anti-SARS-CoV-2 antikūnų.Šie žemėlapiai rodo, kad ankstesnis pabėgimo mutacijų apibūdinimas yra neišsamus.Nebuvo nustatyta nei pavienių aminorūgščių mutacijų, kurios galėtų išvengti dviejų antikūnų REGN-COV2 kokteilyje, taip pat nebuvo nustatyta daugumos nuolatinės infekcijos pacientų, gydytų kokteiliu.mutacija.Žinoma, mūsų žemėlapis dar neatsakė į aktualiausią klausimą: ar SARS-CoV-2 sukurs didelį atsparumą šiems antikūnams?Tačiau neabejotina, kad nerimą kelia tai, kad tiek daug pabėgimo mutacijų turi mažai įtakos UBR sulankstymui ar receptorių afinitetui, o cirkuliuojančiuose virusuose jau yra keletas žemo lygio mutacijų.Galų gale reikia palaukti ir stebėti, kokias mutacijas SARS-CoV-2 perduos, kai išplis tarp gyventojų.Mūsų darbas padės „stebėti“, iš karto paaiškindamas mutacijų, klasifikuojamų pagal viruso genomo stebėjimą, poveikį.
Tai yra atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal Creative Commons Attribution License sąlygas.Straipsnis leidžia neribotai naudoti, platinti ir dauginti bet kurioje laikmenoje, jei originalus kūrinys yra tinkamai cituojamas.
Pastaba: prašome jūsų pateikti savo el. pašto adresą tik tam, kad asmuo, kurį rekomenduojate puslapiui, žinotų, jog norite, kad jis matytų el. laišką ir kad tai nėra šlamštas.Mes neužfiksuosime jokių el. pašto adresų.
Šis klausimas naudojamas norint patikrinti, ar esate lankytojas, ir išvengti automatinio šlamšto pateikimo.
Tyleris N.Starras, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adamas S. Dingesas (Adamas S.
Visas SARS-CoV-2 mutacijų, kurios išvengia Regeneron monokloninių antikūnų mišinio, žemėlapis padeda paaiškinti viruso evoliuciją gydant pacientus.
Tyleris N.Starras, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adamas S. Dingesas (Adamas S.
Visas SARS-CoV-2 mutacijų, kurios išvengia Regeneron monokloninių antikūnų mišinio, žemėlapis padeda paaiškinti viruso evoliuciją gydant pacientus.
©2021 Amerikos mokslo pažangos asociacija.Visos teisės saugomos.AAAS yra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ir COUNTER.Science ISSN 1095-9203 partneris.
Paskelbimo laikas: 2021-02-24