Vairākas antivielas jau tiek izmantotas vai tiek izstrādātas kā terapijas metodes COVID-19 ārstēšanai.Parādoties jauniem smaga akūta respiratorā sindroma koronavīrusa 2 (SARS-CoV-2) variantiem, ir svarīgi paredzēt, vai tie joprojām būs jutīgi pret antivielu terapiju.Starr et al.Tika izmantota rauga bibliotēka, kas aptver visas SARS-CoV-2 receptoru saistošā domēna mutācijas, kas nepārkāps saistīšanos ar saimniekreceptoru (ACE2), un kartē, kā šīs mutācijas ietekmē trīs galvenos anti-SARS-CoV. -2 antivielu saistīšanās.Šie skaitļi identificē mutācijas, kas izvairās no antivielu saistīšanās, tostarp atsevišķas mutācijas, kas izkļūst no divām antivielām Regeneron antivielu maisījumā.Cilvēkiem izplatās daudzas mutācijas, kas izbēg no vienas antivielas.
Antivielas ir potenciāla terapija smaga akūta respiratorā sindroma koronavīrusa 2 (SARS-CoV-2) ārstēšanai, taču nav skaidrs, vai vīruss attīstās, lai izvairītos no tā riska.Šeit mēs kartējam, kā visas mutācijas SARS-CoV-2 receptoru saistošajā domēnā (RBD) ietekmē REGN-COV2 kokteiļa saistīšanos ar antivielu LY-CoV016.Šīs pilnīgas kartes atklāja aminoskābju mutāciju, kas pilnībā izvairījās no REGN-COV2 maisījuma, kas sastāv no divām antivielām REGN10933 un REGN10987, kas vērstas uz dažādiem strukturāliem epitopiem.Šie skaitļi identificē arī vīrusu mutācijas, kas atlasītas pastāvīgi inficētiem pacientiem, kuri tika ārstēti ar REGN-COV2, un in vitro vīrusu evakuācijas atlases laikā.Visbeidzot, šie skaitļi atklāj, ka mutācijas, kas izbēg no vienas antivielas, jau ir sastopamas cirkulējošajos SARS-CoV-2 celmos.Šīs pilnīgas bēgšanas kartes var izskaidrot vīrusu uzraudzības laikā novēroto mutāciju sekas.
Antivielas tiek izstrādātas, lai ārstētu smagu akūtu respiratorā sindroma koronavīrusu 2 (SARS-CoV-2) (1).Antivielas pret noteiktiem citiem vīrusiem var padarīt neefektīvas vīrusu mutāciju dēļ, kas atlasītas inficētu pacientu ārstēšanas laikā (2, 3), vai vīrusu mutācijas, kas ir izplatījušās visā pasaulē, lai nodrošinātu rezistenci pret visu vīrusa kladu.Tāpēc, lai novērtētu, kā vīrusa uzraudzības laikā novērotās mutācijas ietekmē antivielu terapijas efektivitāti, ir ļoti svarīgi noteikt, kuras SARS-CoV-2 mutācijas var izvairīties no galvenajām antivielām.
Lielākā daļa vadošo anti-SARS-CoV-2 antivielu ir vērstas pret vīrusa receptoru saistošo domēnu (RBD), kas veicina saistīšanos ar angiotenzīnu konvertējošā enzīma 2 (ACE2) receptoru (5, 6).Nesen mēs esam izstrādājuši dziļu mutāciju skenēšanas metodi, lai kartētu, kā visas RBD mutācijas ietekmē tā darbību un pretvīrusu antivielu atpazīšanu (7, 8).Metode ietver RBD mutantu bibliotēkas izveidi, to ekspresiju uz rauga virsmas un fluorescences aktivētu šūnu šķirošanu un dziļo sekvencēšanu, lai kvantitatīvi noteiktu, kā katra mutācija ietekmē URB locīšanu, ACE2 afinitāti (mēra titrēšanas sērijā) un antivielu saistīšanos. (S1A attēls).Šajā pētījumā mēs izmantojām (7) aprakstīto atkārtoto mutantu bibliotēku, kas sastāv no svītrkodiem RBD variantiem, kas aptver 3804 no 3819 iespējamām aminoskābju mutācijām.Mūsu bibliotēka tika sagatavota no agrīnā izolāta Wuhan-Hu-1 UBD ģenētiskā fona.Lai gan vairāku mutantu biežums palielinās, tie joprojām ir visizplatītākās UBR sekvences (9, 10).Mēs esam uzzīmējuši divas no 2034 mutācijām, kas spēcīgi neizjauc URB locīšanu un AKE saistīšanos (7), kā izvadīt REGN-COV2 kokteili (REGN10933 un REGN10987) (11, 12) un Eli Lilly's LY-CoV016 Rekombinantā forma antiviela ietekmē antivielu saistīšanas metodi (saukta arī par CB6 vai JS016) (13) (S1B attēls).REGN-COV2 nesen tika piešķirta ārkārtas lietošanas atļauja saistībā ar Covid-19 (14), savukārt LY-CoV016 pašlaik tiek veikti 3. fāzes klīniskie pētījumi (15).
[Glu406→Trp(E406W)] spēcīgi izvairījās no divu antivielu maisījuma (1.A attēls).LY-CoV016 evakuācijas karte atklāja arī daudzas evakuācijas mutācijas dažādās UBD vietās (1B attēls).Lai gan dažas evakuācijas mutācijas var pasliktināt RBD spēju saistīties ar ACE2 vai izpausties atbilstoši salocītā veidā, saskaņā ar iepriekšējiem dziļo mutāciju skenēšanas mērījumiem, izmantojot rauga attēlotu RBD, daudzām funkcionālām mutācijām ir maza ietekme uz šīm funkcionālajām īpašībām vai tās nav vispār (7). ) (1. attēls, A un B attēlo ACE2 afinitātes zudumu, savukārt S2 attēlā ir redzama UBR ekspresijas samazināšanās.
(A) Antivielas kartēšana REGN-COV2.Līniju diagramma kreisajā pusē parāda aizbēgšanu katrā UBD vietā (visu mutāciju summa katrā vietā).Logotipa attēlā labajā pusē ir redzama spēcīgā aizbēgšanas vieta (violeta pasvītrojums).Katra burta augstums ir proporcionāls aminoskābju mutācijas izraisītās aizbēgšanas stiprumam, un “aizbēgšanas rādītājs” 1 katrai mutācijai atbilst pilnīgai aizbēgšanai.Y ass skala katrai rindai ir atšķirīga, tāpēc, piemēram, E406W izvairās no visām REGN antivielām, bet tas ir visredzamākais kokteiļiem, jo to pārņem citas atsevišķu antivielu evakuācijas vietas.Mērogojamajai versijai S2, A un B tiek izmantoti, lai krāsotu karti pēc tā, kā mutācijas ietekmē salocītā UBR izteiksmi.S2, C un D izmanto, lai sadalītu ietekmi uz ACE2 afinitāti un RBD ekspresiju starp visām mutācijām, kas novērotas cirkulējošo vīrusu izolātos.(B) Kā parādīts (A), uzzīmējiet LY-CoV016.(C) Izmantojiet pseidotipa lentivīrusa daļiņas, lai pārbaudītu galvenās mutācijas neitralizācijas testā.Mēs izvēlējāmies pārbaudīt mutācijas, kurām, domājams, būs lielāka ietekme vai kuras pastāv augstā biežumā SARS-CoV-2 izolātos (piemēram, N439K) cirkulācijā.Katrs punkts atspoguļo mutācijas vidējās inhibējošās koncentrācijas (IC50) pieaugumu, salīdzinot ar nemutētā savvaļas tipa (WT), kas satur D614G, maksimumu.Zilā punktētā līnija 1 apzīmē neitralizācijas efektu, kas ir līdzīgs WT, un vērtība> 1 apzīmē paaugstinātu neitralizācijas pretestību.Punkta krāsa norāda, vai vēlaties aizbēgt no kartes.Punkti norāda, ka, tā kā IC50 ir ārpus izmantotās atšķaidīšanas sērijas, tiek pārbaudīta daudzkārtēja maiņa (augšējā vai apakšējā robeža).Lielākā daļa mutantu tiek pārbaudīti divos eksemplāros, tāpēc ir divi punkti.Pilnīga neitralizācijas līkne ir parādīta 2. attēlā. S3.Aminoskābju atlikumu viena burta saīsinājumi ir šādi: A, Ala;C, cisteīns;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, viņa;Es, Īle;K, lizīns;L, Liu;Metropole N, Assen;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptofāns;un Y, Tyr.
Lai pārbaudītu galveno mutāciju antigēno iedarbību, mēs veicām neitralizācijas testu, izmantojot panicles pseidotipa lentivīrusu daļiņas, un konstatējām, ka pastāv konsekvence starp antivielu saistīšanas evakuācijas karti un neitralizācijas testu (1.C attēls un S3 attēls).Kā paredzēts REGN-COV2 antivielu kartē, mutāciju 486. pozīcijā neitralizē tikai REGN10933, savukārt mutāciju 439. un 444. pozīcijā neitralizē tikai REGN10987, tāpēc šīs mutācijas nevar izvairīties.Bet E406W izbēga no divām REGN-COV2 antivielām, tāpēc tas arī spēcīgi izkļuva no maisījuma.Izmantojot strukturālo analīzi un vīrusu aizbēgšanas atlasi, Regeneron uzskata, ka neviena aminoskābes mutācija nevar izvairīties no divām kokteiļa antivielām (11, 12), taču mūsu pilnajā kartē E406W ir identificēta kā kokteiļa evakuācijas mutācija.E406W salīdzinoši specifiskā veidā ietekmē REGN-COV2 antivielu un nopietni netraucē URB darbību, jo tas tikai nedaudz samazina LY-CoV016 neitralizācijas efektu (1.C attēls) un pseidotipa lentivīrusa daļiņu titru (attēls S3F).
Lai noskaidrotu, vai mūsu evakuācijas karte atbilst vīrusu evolūcijai antivielu atlases laikā, mēs vispirms pārbaudījām Regeneron vīrusa evakuācijas selekcijas eksperimenta datus, kurā ekspresijas smaile tika audzēta šūnu kultūrā jebkura REGN10933 klātbūtnē. stomatīta vīruss (VSV), REGN10987 vai REGN-COV2 kokteilis (12).Šis darbs identificēja piecas evakuācijas mutācijas no REGN10933, divas evakuācijas mutācijas no REGN10987 un nekādas mutācijas no kokteiļa (2.A attēls).Visu septiņu šūnu kultūru atlasītās mutācijas ir izceltas mūsu evakuācijas kartē, un ir pieejama arī savvaļas tipa kodona viena nukleotīda maiņa Uhaņas-Hu-1 URB secībā (2.B attēls), kas norāda uz atšķirību starp aizbēgšanu. grafiks un vīrusa evolūcija zem antivielu spiediena šūnu kultūrā.Ir vērts atzīmēt, ka E406W nevar piekļūt, mainot vienu nukleotīdu, kas var izskaidrot, kāpēc Regeneron kokteiļu atlase to nevar identificēt, neskatoties uz salīdzinoši labo RBD locīšanas un ACE2 afinitātes toleranci.
(A) Antivielu klātbūtnē Regeneron izmanto panicles pseidotipu VSV, lai atlasītu vīrusa evakuācijas mutācijas šūnu kultūrā (12).(B) Aizbēgšanas diagramma, kā parādīts 1.A attēlā, bet parāda tikai tās mutācijas, kas pieejamas ar vienu nukleotīda izmaiņu Wuhan-Hu-1 secībā.Ne-pelēks norāda uz mutācijām šūnu kultūrā (sarkans) un inficētiem pacientiem (zils) vai abām (violeta).S5 attēlā parādīti šie grafiki, kas ir iekrāsoti pēc tā, kā mutācijas ietekmē ACE2 afinitāti vai RBD ekspresiju.(C) RBD mutācijas kinētika pacientiem, kas ārstēti ar REGN-COV2 145. infekcijas dienā (melna punktēta vertikāla līnija).Savienojuma biežums starp E484A un F486I palielinājās, taču, tā kā E484A mūsu attēlā nav evakuācijas mutācija, tas nav parādīts citos paneļos.Skatīt arī attēlu.S4.(D) Evakuācijas mutācijas, kas rodas šūnu kultūrā un inficētiem pacientiem, ir pieejamas ar vienu nukleotīdu, un evakuācijas antivielu saistīšanās nerada lielas izmaksas ACE2 afinitātei [mērot ar rauga displeja metodi (7)].Katrs punkts ir mutācija, un tā forma un krāsa norāda, vai vīrusa augšanas laikā tam var piekļūt un to var atlasīt.Vairāk labās puses punktu uz x ass norāda uz spēcīgāku antivielu saistīšanās aizplūšanu;augstākie punkti uz y ass norāda uz augstāku ACE2 afinitāti.
Lai noteiktu, vai Escape Atlas var analizēt cilvēkus inficējošo vīrusu attīstību, mēs pārbaudījām dziļās sekvences datus no ilgstoši inficēta pacienta ar imūndeficītu, kurš saņēma REGN-COV2 145. dienā pēc COVID-19 ārstēšanas diagnozes noteikšanas (16).Novēlota ārstēšana ļauj pacienta vīrusu populācijai uzkrāt ģenētisko daudzveidību, no kurām daļu var izraisīt imūnstress, jo pacientam pirms ārstēšanas ir vāja autoneitralizējoša antivielu reakcija (16).Pēc REGN-COV2 ievadīšanas piecu aminoskābju mutāciju biežums UBR strauji mainījās (attēls 2C un attēls S4).Mūsu bēgšanas karte parādīja, ka trīs no šīm mutācijām izbēga no REGN10933 un viena no REGN10987 (2.B attēls).Ir vērts atzīmēt, ka pēc antivielu apstrādes ne visas mutācijas tika pārnestas uz fiksēto vietu.Gluži pretēji, konkurence pieaug un samazinās (2.C attēls).Šis modelis ir novērots citu vīrusu adaptīvo saimnieku iekšējā evolūcijā (17, 18), iespējams, konkurences dēļ starp ģenētisko brīvo izjādes un vīrusu izcelsmi.Šķiet, ka abiem šiem spēkiem ir nozīme pacientiem ar pastāvīgu infekciju (attēls 2C un attēls S4C): E484A (mūsu diagrammā nav evakuācijas mutācija) un F486I (escape REGN10933) pēc ārstēšanas, un vīrusu cilmes, kas pārnēsā N440D un Q493K (attiecīgi izbēgot no REGN10987 un REGN10933) vispirms sacentās ar REGN10933 evakuācijas mutantu Y489H un pēc tam sacentās ar ciltsrakstu, kas nes E484A un F486I un Q493K.
Trīs no četrām evakuācijas mutācijām pacientiem, kuri tika ārstēti ar REGN-COV2, netika identificēti Regeneron vīrusa šūnu kultūras atlasē (2.B attēls), kas ilustrē visas kartes priekšrocības.Vīrusu atlase ir nepilnīga, jo tie var identificēt tikai visas mutācijas, kas nejauši atlasītas konkrētajā šūnu kultūras eksperimentā.Gluži pretēji, pilnā karte anotē visas mutācijas, kas var ietvert mutācijas, ko izraisa ar ārstēšanu nesaistīti iemesli, bet nejauši ietekmē antivielu saistīšanos.
Protams, vīrusu evolūciju ietekmē funkcionālie ierobežojumi un spiediens izvairīties no antivielām.Šūnu kultūrā atlasītās mutācijas un pacienti vienmēr atbilst šādiem kritērijiem: tie izvairās no antivielu saistīšanās, var iekļūt, mainot vienu nukleotīdu, un tiem ir maza vai vispār nav jāmaksā par ACE2 afinitāti [ar iepriekšējām dziļajām mutācijām, kas parādītas, izmantojot rauga skenēšanas mērījumu RBD (7) )] (2.D attēls un S5. attēls).Tāpēc, lai novērtētu iespējamos vīrusa evolūcijas ceļus, var izmantot pilnīgu karti par to, kā mutācijas ietekmē galvenos RBD bioķīmiskos fenotipus (piemēram, AKE un antivielu saistīšanos).Viens brīdinājums ir tāds, ka ilgākā evolūcijas laika posmā, kā novērots vīrusu imunitātē un zāļu izkļūšanā, epistatiskas mijiedarbības dēļ mutāciju tolerances telpa var mainīties (19-21).
Pilnīga karte ļauj mums novērtēt esošās evakuācijas mutācijas cirkulējošajā SARS-CoV-2.Mēs pārbaudījām visas pieejamās no cilvēka iegūtās SARS-CoV-2 sekvences 2021. gada 11. janvārī un konstatējām, ka liels skaits URB mutāciju ir izbēgušas no vienas vai vairākām antivielām (3. attēls).Tomēr vienīgā evakuācijas mutācija, kas atrodas >0,1% sekvences, ir REGN10933 evakuācijas mutants Y453F [0,3% no sekvences;sk. (12)], REGN10987 evakuācijas mutants N439K [1,7% no sekvences;sk. 1.C un (22) attēlu], un LY-CoV016 aizbēg no mutācijas K417N (0,1% secība; skatīt arī 1C attēlu).Y453F ir saistīts ar neatkarīgiem uzliesmojumiem, kas saistīti ar ūdeļu fermām Nīderlandē un Dānijā (23, 24);ir vērts atzīmēt, ka pati ūdeļu secība dažkārt satur citas evakuācijas mutācijas, piemēram, F486L (24).N439K ir ļoti populārs Eiropā un veido lielu daļu no Skotijas un Īrijas Eiropā (22, 25).K417N pastāv B.1.351 ciltsrakstā, kas pirmo reizi atklāts Dienvidāfrikā (10).Vēl viena aktuāla mutācija ir N501Y, kas atrodas B.1.351 un arī B.1.1.7 ciltsrakstā, kas sākotnēji tika identificēts Apvienotajā Karalistē (9).Mūsu karte parāda, ka N501Y neietekmē REGN-COV2 antivielu, bet tikai mēreni ietekmē LY-CoV016 (3. attēls).
Katrai antivielai vai antivielu kombinācijai uz 2021. gada 11. janvāri starp 317 866 augstas kvalitātes cilvēka iegūtajām SARS-CoV-2 sekvencēm GISAID (26) ir norādīta saistība starp katras mutācijas izzušanas punktu skaitu un tās biežumu .Tas ir atzīmēts.REGN-COV2 kokteiļa evakuācijas mutācijai E406W ir nepieciešamas vairākas nukleotīdu izmaiņas Wuhan-Hu-1 RBD secībā, un tā nav novērota GISAID secībā.Citas E406 atlikuma mutācijas (E406Q un E406D) tika novērotas ar zemas frekvences skaitīšanu, taču šīs mutantās aminoskābes nav viena nukleotīda mutācijas, kas atrodas tālu no W.
Kā gaidīts, evakuācijas mutācijas parasti notiek antivielu un RBD saskarnē.Tomēr ar struktūru vien nepietiek, lai prognozētu, kuras mutācijas ir starpnieks aizbēgšanai.Piemēram, LY-CoV016 izmanto savas smagās un vieglās ķēdes, lai saistās ar plašu epitopu, kas pārklājas ar ACE2 saistīšanās virsmu, bet evakuācijas process ietver mutācijas UBR atlikumos smagās ķēdes komplementaritāti noteicošajā reģionā (4.A attēls un S6, E attēls). G).Turpretim izplūdes no REGN10933 un REGN10987 galvenokārt notika URB atliekās, kas bija sakrautas antivielu smago un vieglo ķēžu saskarnē (4.A attēls un S6 attēls, A līdz D).E406W mutācija, kas izkļuva no REGN-COV2 maisījuma, radās pie atliekām, kas nebija saskarē ne ar vienu antivielu (4. attēls, A un B).Lai gan E406 ir strukturāli tuvāks LY-CoV016 (4.B un S6H attēls), E406W mutācijai ir daudz mazāka ietekme uz antivielu (1., B un C attēls), norādot, ka īpašais liela attāluma strukturālais mehānisms ir anti-REGN. - COV2 antiviela (S6I attēls).Rezumējot, mutācijas UBR atlikumos, kas nonāk saskarē ar antivielām, ne vienmēr veicina izkļūšanu, un dažas nozīmīgas evakuācijas mutācijas rodas atlikumos, kas nav saskarē ar antivielām (4.B attēls un S6, D un G attēls).
(A) Izplūdes diagramma, kas projicēta uz URB struktūras, ko saista antiviela.[REGN10933 un REGN10987: proteīnu datu bāzes (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PBP ID 7C01 (13)].Antivielu smago un vieglo ķēžu mainīgie domēni ir parādīti kā zilas karikatūras, un krāsa uz UBR virsmas norāda uz mutāciju izraisītas izkļūšanas stiprumu šajā vietā (balts norāda, ka nav izkļūšanas, un sarkans norāda uz spēcīgāko. antivielas vai maisījuma izkļūšanas vieta).Vietnes, kurām nav funkcionāli mutācijas, ir pelēkotas.(B) Katrai antivielai klasificējiet vietu kā tiešo saskari ar antivielu (ne-ūdeņraža atomi 4Å robežās no antivielas), proksimālo antivielu (4 līdz 8Å) vai distālo antivielu (> 8Å).Katrs punkts apzīmē vietni, kas ir sadalīta aizbēgšanas (sarkanā) vai neizbēgamā (melnā) daļā.Pelēkā punktētā līnija apzīmē kritisko vērtību, kas izmantota, lai klasificētu vietni kā aizbēgt vai neizbēgamu (sīkāku informāciju skatiet sadaļā Materiāli un metodes).Sarkanais un melnais cipars norāda, cik vietņu katrā kategorijā ir atsoļotas vai nav.
Šajā pētījumā mēs esam pilnībā kartējuši mutācijas, kas izvairās no trim galvenajām anti-SARS-CoV-2 antivielām.Šīs kartes norāda, ka iepriekšējais evakuācijas mutāciju raksturojums ir nepilnīgs.Nav identificētas ne atsevišķas aminoskābes mutācijas, kas varētu izvairīties no abām REGN-COV2 kokteiļa antivielām, ne arī tās identificēja lielāko daļu no pastāvīgas infekcijas pacientu, kas ārstēti ar kokteili.mutācija.Protams, mūsu karte vēl nav atbildējusi uz aktuālāko jautājumu: vai SARS-CoV-2 attīstīs plašu rezistenci pret šīm antivielām?Bet noteikti ir tas, ka satraucoši ir tas, ka tik daudzām bēgšanas mutācijām ir maza ietekme uz URB locīšanu vai receptoru afinitāti, un cirkulējošajos vīrusos jau ir dažas zema līmeņa mutācijas.Galu galā ir jāgaida un jānovēro, kādas mutācijas SARS-CoV-2 pārnēsīs, kad tas izplatīsies iedzīvotāju vidū.Mūsu darbs palīdzēs "novērošanai", nekavējoties izskaidrojot vīrusu genoma uzraudzības klasificēto mutāciju ietekmi.
Šis ir atvērtas piekļuves raksts, kas tiek izplatīts saskaņā ar Creative Commons attiecinājuma licences noteikumiem.Rakstā ir atļauts neierobežoti izmantot, izplatīt un reproducēt jebkurā datu nesējā ar nosacījumu, ka oriģinālais darbs ir pareizi citēts.
Piezīme. Mēs lūdzam jūs norādīt tikai savu e-pasta adresi, lai lapai ieteiktā persona zinātu, ka vēlaties, lai tā redz e-pastu un ka tas nav mēstule.Mēs neuzņemsim nevienu e-pasta adresi.
Šis jautājums tiek izmantots, lai pārbaudītu, vai esat apmeklētājs, un novērstu automātisku surogātpasta iesniegšanu.
Tailers N. Stārs, Elisons Dž.Grīnijs, Amins Adetija, Viljams V. Hanons, Menišs K. Šodharijs (Manišs K. Šodharijs), Ādams S. Dingss (Adams S.
Pilnīga SARS-CoV-2 mutāciju karte, kas izbēg no Regeneron monoklonālo antivielu maisījuma, palīdz izskaidrot vīrusa attīstību pacientu ārstēšanā.
Tailers N. Stārs, Elisons Dž.Grīnijs, Amins Adetija, Viljams V. Hanons, Menišs K. Šodharijs (Manišs K. Šodharijs), Ādams S. Dingss (Adams S.
Pilnīga SARS-CoV-2 mutāciju karte, kas izbēg no Regeneron monoklonālo antivielu maisījuma, palīdz izskaidrot vīrusa attīstību pacientu ārstēšanā.
©2021 Amerikas Zinātnes attīstības asociācija.Visas tiesības aizsargātas.AAAS ir HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef un COUNTER.Science ISSN 1095-9203 partneris.
Izlikšanas laiks: 2021. gada 24. februāris