Неколку антитела се веќе во употреба или во развој како терапии за третман на СОВИД-19.Со појавата на нови варијанти на тежок акутен респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2), важно е да се предвиди дали тие сè уште ќе бидат подложни на терапија со антитела.Стар и сор.Користена е библиотека со квасец, која ги опфаќа сите мутации во доменот за врзување на рецепторот SARS-CoV-2 што нема силно да го наруши врзувањето со рецепторот домаќин (ACE2) и да мапира како овие мутации влијаат на трите главни анти-SARS-CoV -2 врзување на антитела.Овие бројки ги идентификуваат мутациите кои бегаат од врзувањето на антителата, вклучително и единечните мутации кои бегаат од двете антитела во мешавината на антитела Regeneron.Многу мутации кои бегаат од едно антитело се шират кај луѓето.
Антителата се потенцијална терапија за третман на тежок акутен респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2), но не е јасно дали вирусот се развива за да го избегне нивниот ризик.Овде, мапираме како сите мутации во доменот за врзување на рецепторот SARS-CoV-2 (RBD) влијаат на врзувањето на коктелот REGN-COV2 со антителото LY-CoV016.Овие целосни мапи открија мутација на аминокиселина која целосно ја избегна мешавината REGN-COV2, која е составена од две антитела REGN10933 и REGN10987 кои се насочени кон различни структурни епитопи.Овие бројки, исто така, идентификуваат мутации на вируси избрани кај постојано инфицирани пациенти третирани со REGN-COV2 и за време на селекција на бегство на вирусот ин витро.Конечно, овие бројки откриваат дека мутациите што бегаат од едно антитело веќе се присутни во циркулирачките соеви САРС-КоВ-2.Овие целосни мапи за бегство можат да ги објаснат последиците од мутациите забележани за време на надзорот на вирусот.
Се развиваат антитела за лекување на тежок акутен респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2) (1).Антителата против одредени други вируси може да бидат неефикасни со мутации на вируси избрани за време на третманот на заразени пациенти (2, 3) или вирусни мутации кои се шират глобално за да донесат отпорност на целиот вирус.Затоа, одредувањето кои мутации на SARS-CoV-2 можат да избегаат од клучните антитела е од клучно значење за да се процени како мутациите забележани за време на надзорот на вирусот влијаат на ефикасноста на терапијата со антитела.
Повеќето водечки анти-САРС-КоВ-2 антитела го таргетираат доменот за врзување на вирусниот рецептор (RBD), кој посредува врз поврзувањето со рецепторот на ангиотензин конвертирачкиот ензим 2 (ACE2) (5, 6).Неодамна, развивме метод за скенирање на длабоки мутации за да мапираме како сите мутации на RBD влијаат на неговата функција и препознавање од антивирусни антитела (7, 8).Методот вклучува создавање на библиотека на RBD мутанти, нивно изразување на површината на квасецот и користење на сортирање на клетки активирани со флуоресценција и длабоко секвенционирање за да се измери како секоја мутација влијае на преклопувањето на RBD, афинитетот ACE2 (мерено во серија на титрација) и врзувањето на антителата (Слика S1A).Во оваа студија, ја користевме библиотеката со повторувачки мутанти опишана во (7), која е составена од баркодирани варијанти на RBD, покривајќи 3804 од 3819 можни мутации на аминокиселини.Нашата библиотека беше подготвена од генетската позадина на RBD на раниот изолат Вухан-Ху-1.Иако фреквенцијата на неколку мутанти се зголемува, тие сè уште ги претставуваат најчестите RBD секвенци (9, 10).Нацртавме две од 2034 мутации кои не го нарушуваат силно преклопувањето на RBD и ACE врзувањето (7) како да се помине коктелот REGN-COV2 (REGN10933 и REGN10987) (11, 12) и LY-CoV016 на рекомбинантната форма на Eli Lilly антителото влијае на методот на врзување на антителото (исто така наречено CB6 или JS016) (13) (Слика S1B).На REGN-COV2 неодамна му беше доделено овластување за итна употреба за COVID-19 (14), додека LY-CoV016 моментално минува низ клиничките испитувања во фаза 3 (15).
[Glu406→Trp(E406W)] силно избега од мешавината на две антитела (Слика 1А).Мапата за бегство на LY-CoV016, исто така, откри многу мутации за бегство на различни места во RBD (Слика 1Б).Иако некои бегство мутации може да ја нарушат способноста на RBD да се поврзе со ACE2 или да се изрази во соодветно преклопена форма, според претходните мерења на длабоко скенирање на мутации користејќи RBD прикажана со квасец, многу функционални мутации имаат мало или никакво влијание врз овие функционални својства (7 ) (Слика 1, А и Б го претставуваат губењето на афинитетот на ACE2, додека сликата S2 го претставува намалувањето на изразувањето на RBD.
(А) Мапирање на антителата во REGN-COV2.Линискиот графикон лево го покажува бегството на секоја локација во RBD (збирот на сите мутации на секоја локација).Сликата со логото на десната страна ја покажува силната локација за бегство (виолетово подвлечено).Висината на секоја буква е пропорционална на јачината на бегството посредувано од мутацијата на аминокиселините, а „оценката за бегство“ од 1 за секоја мутација одговара на целосно бегство.Скалата на y-оската е различна за секој ред, така што, на пример, E406W ги избегнува сите REGN антитела, но најочигледно е за коктели бидејќи е преплавен од другите места за бегство на поединечни антитела.За скалабилната верзија, S2, A и B се користат за бојадисување на картата според тоа како мутациите влијаат на изразувањето на преклопено RBD.S2, C и D се користат за дистрибуирање на влијанието врз афинитетот на ACE2 и RBD експресијата меѓу сите мутации забележани во циркулирачките вирусни изолати.(Б) Како што е прикажано во (А), нацртајте LY-CoV016.(В) Користете лентивирусни честички со псевдотип за шилести за да ги потврдите клучните мутации во анализата за неутрализација.Избравме да ги потврдиме мутациите за кои се предвидува дека ќе имаат поголемо влијание или постојат на висока фреквенција во изолатите на SARS-CoV-2 (како N439K) во циркулацијата.Секоја точка го претставува двојното зголемување на средната инхибиторна концентрација (IC50) на мутацијата во однос на врвот на немутираниот див тип (WT) кој содржи D614G.Сината испрекината линија 1 претставува ефект на неутрализација сличен на WT, а вредноста> 1 претставува зголемен отпор на неутрализација.Бојата на точката покажува дали сакате да избегате од картата.Точките покажуваат дека бидејќи IC50 е надвор од употребената серија на разредување, се проверува повеќекратната промена (горната или долната граница).Повеќето мутанти се тестираат во дупликат, така што има две точки.Целосната крива на неутрализација е прикажана на слика 2. S3.Кратенките со една буква на остатоците од аминокиселини се како што следува: A, Ala;C, цистеин;D, Asp;Е, Глу;F, Phe;G, Gly;H, неговиот;јас, Иле;К, лизин;Л, Лиу;Митрополис Н, Асен;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Вал;W, триптофан;и Y, Тир.
Со цел да се потврди антигенскиот ефект на клучните мутации, извршивме анализа на неутрализација користејќи лентивирусни честички со псевдотип на паника и откривме дека постои конзистентност помеѓу мапата за бегство за врзување на антителата и анализата за неутрализација (слика 1C и слика S3).Како што се очекува од картата на антитела REGN-COV2, мутацијата на позицијата 486 е неутрализирана само со REGN10933, додека мутацијата на позициите 439 и 444 е неутрализирана само со REGN10987, така што овие мутации не можат да избегаат.Но, E406W ги избегна двата антитела REGN-COV2, така што исто така силно избега од смесата.Преку структурна анализа и избор на бегство од вируси, Регенерон верува дека ниту една мутација на аминокиселина не може да избега од двете антитела во коктелот (11, 12), но нашата целосна мапа го идентификува E406W како мутација за бегство од коктел.E406W влијае на антителото REGN-COV2 на релативно специфичен начин и не се меша сериозно во функцијата на RBD, бидејќи само малку го намалува ефектот на неутрализација на LY-CoV016 (слика 1C) и титарот на шилести псевдотипизирани лентивирусни честички ( Слика S3F).
Со цел да се истражи дали нашата карта за бегство е конзистентна со еволуцијата на вирусите под селекција на антитела, прво ги проверивме податоците од експериментот за избор на бегство од вирусот Regeneron, во кој шилестата на изразување беше одгледувана во клеточна култура во присуство на било кој REGN10933 Везикуларниот вирус на стоматитис (VSV), коктел REGN10987 или REGN-COV2 (12).Оваа работа идентификуваше пет мутации за бегство од REGN10933, две мутации за бегство од REGN10987 и нема мутации од коктел (Слика 2А).Мутациите избрани од сите седум клеточни култури се нагласени во нашата мапа за бегство, а исто така е достапна промената на еден нуклеотид на кодонот од див тип во Wuhan-Hu-1 RBD секвенцата (Слика 2Б), што ја покажува разликата помеѓу бегствата Конкорданса график и еволуција на вирусот под притисок на антитела во клеточна култура.Вреди да се напомене дека E406W не може да се пристапи со единечни нуклеотидни промени, што може да објасни зошто изборот на коктел Regeneron не може да го идентификува и покрај релативно добрата толеранција на RBD преклопување и ACE2 афинитет.
(А) Во присуство на антитела, Regeneron користи псевдотип на паника VSV за да избере мутации за бегство од вируси во клеточната култура (12).(Б) Дијаграмот за бегство, како што е прикажано на Слика 1А, но ги прикажува само мутациите достапни со една нуклеотидна промена во секвенцата Вухан-Ху-1.Не-сивата боја укажува на мутации во клеточната култура (црвена), и заразените пациенти (сина) или и двете (виолетови).Слика S5 ги прикажува овие графикони, кои се обоени според тоа како мутациите влијаат на афинитетот на ACE2 или на изразувањето на RBD.(В) Кинетика на RBD мутација кај пациенти третирани со REGN-COV2 на 145-тиот ден од инфекцијата (вертикална линија со црни точки).Фреквенцијата на поврзување помеѓу E484A и F486I се зголеми, но бидејќи E484A не е мутација за бегство во нашата слика, таа не е прикажана во другите панели.Видете исто така слика.S4.(Г) Мутациите за бегство што се случуваат во клеточната култура и инфицираните пациенти се достапни со еден нуклеотид, а врзувањето на бегачките антитела не предизвикува голема цена за афинитетот на ACE2 [мерено со методот на прикажување на квасец (7)].Секоја точка е мутација, а нејзината форма и боја покажуваат дали може да се пристапи и да се избере за време на растот на вирусот.Колку повеќе точки од десната страна на x-оската укажуваат на посилно бегство на врзување на антителата;повисоките точки на y-оската укажуваат на поголем ACE2 афинитет.
Со цел да утврдиме дали Escape Atlas може да ја анализира еволуцијата на вирусите што ги инфицираат луѓето, ги испитавме податоците за длабоко секвенционирање од упорно инфициран имунокомпромитиран пациент кој примил REGN-COV2 на 145-тиот ден по дијагнозата на Третманот COVID-19 (16).Доцниот третман и овозможува на вирусната популација на пациентот да акумулира генетска разновидност, од кои некои може да бидат поттикнати од имунолошкиот стрес, бидејќи пациентот има слаб одговор на автонеутрализирачки антитела пред третманот (16).По администрацијата на REGN-COV2, фреквенцијата на пет мутации на амино киселини во RBD брзо се промени (слика 2C и слика S4).Нашата карта за бегство покажа дека три од овие мутации избегале од REGN10933 и една избегала од REGN10987 (Слика 2Б).Вреди да се напомене дека по третманот со антитела, не сите мутации беа пренесени на фиксното место.Напротив, постои пораст и пад на конкуренцијата (Слика 2В).Овој модел е забележан во внатрешната еволуција на приспособливите домаќини на други вируси (17, 18), веројатно поради конкуренцијата помеѓу генетските слободи и вирусните лози.И двете од овие сили се чини дека играат улога кај пациенти со перзистентна инфекција (слика 2C и слика S4C): E484A (не е мутација за бегство во нашиот дијаграм) и F486I (бегство од REGN10933) слободно возење по третманот и лоза вируси кои носат N440D и Q493K (избегајќи од REGN10987 и REGN10933, соодветно) прво се натпреваруваше со REGN10933 бегство мутант Y489H, а потоа се натпреваруваше со лозата што носи E484A и F486I и Q493K.
Три од четирите бегство мутации кај пациенти третирани со REGN-COV2 не беа идентификувани во изборот на клеточна култура на вирусот на Регенерон (Слика 2Б), што ја илустрира предноста на целосната карта.Изборот на вирусот е нецелосен бидејќи тие можат да идентификуваат само какви било мутации случајно избрани во тој конкретен експеримент со клеточна култура.Напротив, комплетната карта ги означува сите мутации, кои може да вклучуваат мутации предизвикани од причини кои не се поврзани со третманот, но случајно влијаат врз врзувањето на антителата.
Се разбира, еволуцијата на вирусите е под влијание на функционалните ограничувања и притисокот за избегнување на антителата.Мутациите и пациентите избрани во клеточната култура секогаш ги исполнуваат следниве критериуми: тие избегнуваат врзување на антителата, можат да влезат преку една промена на нуклеотид и имаат мала или никаква цена за афинитетот на ACE2 [преку претходните длабоки мутации прикажани со помош на мерење со скенирање квасец RBD (7 )] (Слика 2D и слика S5).Затоа, може да се користи целосна карта за тоа како мутациите влијаат на клучните биохемиски фенотипови на RBD (како што се АКЕ и врзувањето на антителата) за да се проценат можните патишта за еволуција на вирусот.Едно предупредување е дека во подолга еволутивна временска рамка, како што е забележано во вирусниот имунитет и бегството на лекови, поради епистатските интеракции, просторот за толеранција за мутации може да се промени (19-21).
Целосната мапа ни овозможува да ги процениме постоечките мутации за бегство во циркулирачкиот SARS-CoV-2.Ги проверивме сите достапни секвенци на SARS-CoV-2 добиени од човекот од 11 јануари 2021 година и откривме дека голем број мутации на RBD избегале од едно или повеќе антитела (Слика 3).Сепак, единствената мутација присутна во >0,1% од секвенцата е REGN10933 мутант за бегство Y453F [0,3% од секвенцата;види (12)], REGN10987 бегство мутант N439K [1,7% од секвенцата;види Слика 1C и (22)], и LY-CoV016 бегство од мутација K417N (0,1% низа; види исто така Слика 1C).Y453F е поврзан со независни епидемии поврзани со фарми за визон во Холандија и Данска (23, 24);вреди да се напомене дека самата низа од визон понекогаш содржи и други мутации за бегство, како што е F486L (24).N439K е многу популарен во Европа и сочинува голем дел од низата од Шкотска и Ирска во Европа (22, 25).K417N постои во лозата B.1.351 првпат откриена во Јужна Африка (10).Друга мутација од моментална загриженост е N501Y, која е присутна во B.1.351 и исто така во лозата B.1.1.7 првично идентификувана во ОК (9).Нашата карта покажува дека N501Y нема ефект врз антителата REGN-COV2, туку само умерен ефект врз LY-CoV016 (Слика 3).
За секое антитело или комбинација на антитела, од 11 јануари 2021 година, меѓу 317.866 висококвалитетни секвенци на SARS-CoV-2 добиени од човек на GISAID (26), врската помеѓу резултатот за бегство за секоја мутација и нејзината фреквенција .Тоа е означено.Мутацијата за бегство од коктелот REGN-COV2 E406W бара повеќекратни нуклеотидни промени во Wuhan-Hu-1 RBD секвенцата и не е забележана во GISAID секвенцата.Други мутации на остаток E406 (E406Q и E406D) беа забележани со броење со мала фреквенција, но овие мутантни амино киселини не се единечни нуклеотидни мутации далеку од W.
Како што се очекуваше, мутациите за бегство обично се случуваат во интерфејсот антитело-РБД.Сепак, структурата сама по себе не е доволна за да се предвиди кои мутации посредуваат во бегството.На пример, LY-CoV016 ги користи своите тешки и лесни синџири за да се поврзе со широк епитоп кој се преклопува со површината за врзување ACE2, но процесот на бегство вклучува мутации во остатоците од RBD во регионот што ја одредува комплементарноста на тешкиот ланец (Слика 4А и Слика S6, E до G).Спротивно на тоа, бегствата од REGN10933 и REGN10987 главно се случија на остатоците од RBD наредени на интерфејсот на тешките и лесните синџири на антителата (слика 4А и слика S6, A до D).Мутацијата E406W што избега од мешавината REGN-COV2 се појави на остатоци што не беа во контакт со ниту едно антитело (Слика 4, А и Б).Иако E406 е структурно поблиску до LY-CoV016 (слика 4B и слика S6H), мутацијата E406W има многу помал ефект врз антителото (слика 1, B и C), што покажува дека специфичниот структурен механизам со долг дострел е анти-REGN - антитело COV2 (слика S6I).Накратко, мутациите на остатоците од RBD во контакт со антителата не секогаш посредуваат во бегството, а некои значајни мутации на бегство се случуваат кај остатоци кои не се во контакт со антитела (Слика 4B и Слика S6, D и G).
(А) Дијаграмот за бегство проектиран на структурата на RBD врзана со антителото.[REGN10933 и REGN10987: Протеинска база на податоци (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].Променливите домени на тешките и лесните синџири на антителото се прикажани како сини цртани филмови, а бојата на површината на RBD ја означува силата на бегството посредувано од мутација на оваа локација (белата означува без бегство, а црвената означува најсилна бегство на антителото или смесата) .Сајтовите кои не се функционално мутирани се сиви.(Б) За секое антитело, класифицирајте го местото како директен контакт со антитела (атоми што не се водород во рамките на 4А од антителото), проксимално антитело (4 до 8А) или дистално антитело (> 8А).Секоја точка претставува локација, поделена на escape (црвена) или non-escape (црна).Сивата испрекината линија ја претставува критичната вредност што се користи за класификација на локацијата како бегство или неизбегнување (за детали, видете Материјали и методи).Црвените и црните броеви покажуваат колку локации во секоја категорија се избегнати или неизлезени.
Во оваа студија, ние целосно ги мапиравме мутациите што ги избегнуваат трите главни анти-САРС-КоВ-2 антитела.Овие карти покажуваат дека претходната карактеризација на мутациите за бегство е нецелосна.Ниту една аминокиселинска мутација што може да избега од двете антитела во коктелот REGN-COV2 не се идентификувани, ниту, пак, го идентификувале најголемиот дел од пациентите со постојана инфекција третирани со коктелот.мутација.Се разбира, нашата карта сè уште не одговори на најитните прашање: Дали САРС-КоВ-2 ќе развие голема отпорност на овие антитела?Но, она што е сигурно е дека е загрижувачки што толку многу мутации на бегство имаат мало влијание врз преклопувањето на RBD или афинитетот на рецепторите, а веќе има некои мутации на ниско ниво во циркулирачките вируси.На крајот, потребно е да се почека и да се набљудува какви мутации ќе пренесе САРС-КоВ-2 кога ќе се прошири меѓу населението.Нашата работа ќе помогне во „набљудувањето“ со тоа што веднаш ќе го објасниме влијанието на мутациите класифицирани со надзор на вирусниот геном.
Ова е напис со отворен пристап дистрибуиран според условите на лиценцата за наведување на извор на Криејтив комонс.Статијата дозволува неограничена употреба, дистрибуција и репродукција на кој било медиум под услов оригиналното дело да биде правилно цитирано.
Забелешка: Ние само бараме од вас да ја наведете вашата е-адреса за лицето што го препорачувате на страницата да знае дека сакате да ја види е-поштата и дека не е спам.Нема да фаќаме никакви адреси на е-пошта.
Ова прашање се користи за да се тестира дали сте посетител и да се спречи автоматско поднесување спам.
Тајлер Н.Стар, Алисон Џеј Грини, Амин Адетија, Вилијам В. Ханон, Маниш Ц. Чудари (Маниш Ц. Чудари), Адам С. Дингс (Адам С.
Комплетната карта на мутации на САРС-КоВ-2 што бегаат од мешавината на моноклонални антитела на Регенерон помага да се објасни еволуцијата на вирусот во лекувањето на пациентите.
Тајлер Н.Стар, Алисон Џеј Грини, Амин Адетија, Вилијам В. Ханон, Маниш Ц. Чудари (Маниш Ц. Чудари), Адам С. Дингс (Адам С.
Комплетната карта на мутации на САРС-КоВ-2 што бегаат од мешавината на моноклонални антитела на Регенерон помага да се објасни еволуцијата на вирусот во лекувањето на пациентите.
©2021 Американско здружение за унапредување на науката.Сите права се задржани.AAAS е партнер на HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Време на објавување: 24 февруари 2021 година