Beberapa antibodi sudah digunakan atau dalam pembangunan sebagai terapi untuk rawatan COVID-19.Dengan kemunculan varian baharu coronavirus sindrom pernafasan akut teruk 2 (SARS-CoV-2), adalah penting untuk meramalkan sama ada mereka masih terdedah kepada terapi antibodi.Starr et al.Perpustakaan yis telah digunakan, yang meliputi semua mutasi dalam domain pengikatan reseptor SARS-CoV-2 yang tidak akan sangat mengganggu pengikatan kepada reseptor hos (ACE2), dan memetakan cara mutasi ini mempengaruhi ketiga-tiga Anti-SARS-CoV utama -2 pengikat antibodi.Angka-angka ini mengenal pasti mutasi yang terlepas daripada pengikatan antibodi, termasuk mutasi tunggal yang melarikan diri daripada dua antibodi dalam campuran antibodi Regeneron.Banyak mutasi yang melarikan diri daripada antibodi tunggal merebak pada manusia.
Antibodi adalah terapi yang berpotensi untuk rawatan sindrom pernafasan akut teruk coronavirus 2 (SARS-CoV-2), tetapi tidak jelas bahawa virus itu berkembang untuk melarikan diri daripada risikonya.Di sini, kami memetakan cara semua mutasi dalam domain pengikatan reseptor SARS-CoV-2 (RBD) mempengaruhi pengikatan koktel REGN-COV2 kepada antibodi LY-CoV016.Peta lengkap ini mendedahkan mutasi asid amino yang mengelak sepenuhnya campuran REGN-COV2, yang terdiri daripada dua antibodi REGN10933 dan REGN10987 yang menyasarkan epitop struktur yang berbeza.Angka-angka ini juga mengenal pasti mutasi virus yang dipilih dalam pesakit yang dijangkiti secara berterusan yang dirawat dengan REGN-COV2 dan semasa pemilihan pelarian virus in vitro.Akhirnya, angka-angka ini mendedahkan bahawa mutasi yang melarikan diri daripada antibodi tunggal sudah ada dalam penyebaran strain SARS-CoV-2.Peta pelarian lengkap ini boleh menerangkan akibat mutasi yang diperhatikan semasa pengawasan virus.
Antibodi sedang dibangunkan untuk merawat sindrom pernafasan akut teruk coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (1).Antibodi terhadap virus lain tertentu boleh menjadi tidak berkesan oleh mutasi virus yang dipilih semasa rawatan pesakit yang dijangkiti (2, 3) atau mutasi virus yang telah merebak ke seluruh dunia untuk memberikan ketahanan terhadap keseluruhan klad virus.Oleh itu, menentukan mutasi SARS-CoV-2 yang boleh melepaskan antibodi utama adalah penting untuk menilai bagaimana mutasi yang diperhatikan semasa pengawasan virus mempengaruhi keberkesanan terapi antibodi.
Kebanyakan antibodi anti-SARS-CoV-2 terkemuka menyasarkan domain pengikat reseptor virus (RBD), yang menjadi pengantara pengikatan kepada reseptor enzim penukar angiotensin 2 (ACE2) (5, 6).Baru-baru ini, kami telah membangunkan kaedah pengimbasan mutasi mendalam untuk memetakan bagaimana semua mutasi RBD mempengaruhi fungsi dan pengiktirafannya oleh antibodi antivirus (7, 8).Kaedah ini melibatkan penciptaan perpustakaan mutan RBD, menyatakannya pada permukaan yis, dan menggunakan pengisihan sel diaktifkan pendarfluor dan penjujukan mendalam untuk mengukur cara setiap mutasi mempengaruhi lipatan RBD, pertalian ACE2 (diukur dalam siri titrasi), dan pengikatan antibodi ( Rajah S1A).Dalam kajian ini, kami menggunakan perpustakaan mutan berulang yang diterangkan dalam (7), yang terdiri daripada varian RBD berkod bar, meliputi 3804 daripada 3819 kemungkinan mutasi asid amino.Perpustakaan kami disediakan daripada latar belakang genetik RBD dari Wuhan-Hu-1 yang terpencil awal.Walaupun kekerapan beberapa mutan semakin meningkat, mereka masih mewakili urutan RBD yang paling biasa (9, 10).Kami telah melukis dua daripada mutasi 2034 yang tidak mengganggu lipatan RBD dan pengikatan ACE (7) cara melepasi koktel REGN-COV2 (REGN10933 dan REGN10987) (11, 12) dan Eli Lilly LY-CoV016 Bentuk rekombinan antibodi mempengaruhi kaedah mengikat antibodi (juga dipanggil CB6 atau JS016) (13) (Rajah S1B).REGN-COV2 baru-baru ini telah diberikan kebenaran penggunaan kecemasan untuk COVID-19 (14), manakala LY-CoV016 kini sedang menjalani ujian klinikal fasa 3 (15).
[Glu406→Trp(E406W)] sangat melarikan diri daripada campuran dua antibodi (Rajah 1A).Peta melarikan diri LY-CoV016 juga mendedahkan banyak mutasi melarikan diri di tapak yang berbeza dalam RBD (Rajah 1B).Walaupun sesetengah mutasi melarikan diri boleh menjejaskan keupayaan RBD untuk mengikat ACE2 atau menyatakan dalam bentuk terlipat yang sesuai, menurut ukuran pengimbasan mutasi dalam sebelum ini menggunakan RBD yang dipamerkan yis, banyak mutasi berfungsi mempunyai sedikit atau tiada kesan ke atas sifat fungsi ini (7 ) (Rajah 1, A dan B mewakili kehilangan pertalian ACE2, manakala Rajah S2 mewakili penurunan dalam ungkapan RBD.
(A) Memetakan antibodi dalam REGN-COV2.Graf garis di sebelah kiri menunjukkan pelarian di setiap tapak dalam RBD (jumlah semua mutasi di setiap tapak).Imej logo di sebelah kanan menunjukkan lokasi melarikan diri yang kukuh (garis bawah ungu).Ketinggian setiap huruf adalah berkadar dengan kekuatan pelarian yang dimediasi oleh mutasi asid amino, dan "skor pelarian" 1 untuk setiap mutasi sepadan dengan pelarian lengkap.Skala paksi-y adalah berbeza untuk setiap baris, jadi, sebagai contoh, E406W melarikan diri dari semua antibodi REGN, tetapi ia adalah yang paling jelas untuk koktel kerana ia diliputi oleh tapak pelarian antibodi individu yang lain.Untuk versi berskala, S2, A dan B, digunakan untuk mewarna peta dengan cara mutasi mempengaruhi ekspresi RBD yang dilipat.S2, C dan D digunakan untuk mengedarkan pengaruh pada pertalian ACE2 dan ekspresi RBD di kalangan semua mutasi yang diperhatikan dalam pengasingan virus yang beredar.(B) Seperti yang ditunjukkan dalam (A), lukis LY-CoV016.(C) Gunakan zarah lentiviral spike-pseudotyped untuk mengesahkan mutasi utama dalam ujian peneutralan.Kami memilih untuk mengesahkan mutasi yang diramalkan mempunyai impak yang lebih besar atau wujud pada frekuensi tinggi dalam pengasingan SARS-CoV-2 (seperti N439K) dalam edaran.Setiap titik mewakili peningkatan lipatan kepekatan perencatan median (IC50) mutasi berbanding kemuncak jenis liar (WT) tidak bermutasi yang mengandungi D614G.Garis putus-putus biru 1 mewakili kesan peneutralan yang serupa dengan WT, dan nilai> 1 mewakili peningkatan rintangan peneutralan.Warna titik menunjukkan sama ada anda mahu melarikan diri daripada peta.Titik menunjukkan bahawa memandangkan IC50 berada di luar siri pencairan yang digunakan, perubahan berganda diperiksa (had atas atau bawah).Kebanyakan mutan diuji dalam pendua, jadi terdapat dua mata.Keluk peneutralan lengkap ditunjukkan dalam Rajah 2. S3.Singkatan satu huruf bagi sisa asid amino adalah seperti berikut: A, Ala;C, Sistein;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, beliau;Saya, Ile;K, lisin;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptofan;dan Y, Tyr.
Untuk mengesahkan kesan antigenik mutasi utama, kami melakukan ujian peneutralan menggunakan zarah lentiviral pseudotyped panicle, dan mendapati bahawa terdapat konsistensi antara peta melarikan diri mengikat antibodi dan ujian peneutralan (Rajah 1C dan Rajah S3).Seperti yang dijangkakan daripada peta antibodi REGN-COV2, mutasi pada kedudukan 486 hanya dineutralkan oleh REGN10933, manakala mutasi pada kedudukan 439 dan 444 hanya dineutralkan oleh REGN10987, jadi mutasi ini tidak dapat melarikan diri.Tetapi E406W terlepas daripada dua antibodi REGN-COV2, jadi ia juga terlepas daripada campuran dengan kuat.Melalui analisis struktur dan pemilihan pelarian virus, Regeneron percaya bahawa tiada mutasi asid amino tunggal boleh melarikan diri daripada dua antibodi dalam koktel (11, 12), tetapi peta lengkap kami mengenal pasti E406W sebagai mutasi pelarian koktel.E406W menjejaskan antibodi REGN-COV2 dengan cara yang agak khusus, dan tidak mengganggu fungsi RBD secara serius, kerana ia hanya mengurangkan sedikit kesan peneutralan LY-CoV016 (Rajah 1C) dan titer zarah lentiviral pseudotyped berduri ( Rajah S3F).
Untuk meneroka sama ada peta melarikan diri kami konsisten dengan evolusi virus di bawah pemilihan antibodi, kami mula-mula menyemak data percubaan pemilihan melarikan diri virus Regeneron, di mana lonjakan ekspresi telah ditanam dalam budaya sel dengan kehadiran mana-mana REGN10933 Vesikular virus stomatitis (VSV), REGN10987 atau koktel REGN-COV2 (12).Kerja ini mengenal pasti lima mutasi melarikan diri daripada REGN10933, dua mutasi melarikan diri daripada REGN10987, dan tiada mutasi daripada koktel (Rajah 2A).Mutasi yang dipilih oleh semua tujuh kultur sel diserlahkan dalam peta melarikan diri kami, dan perubahan nukleotida tunggal kodon jenis liar dalam jujukan RBD Wuhan-Hu-1 juga boleh diakses (Rajah 2B), menunjukkan perbezaan antara melarikan diri Concordance graf dan evolusi virus di bawah tekanan antibodi dalam kultur sel.Perlu diingat bahawa E406W tidak boleh diakses dengan perubahan nukleotida tunggal, yang mungkin menjelaskan mengapa pemilihan koktel Regeneron tidak dapat mengenal pastinya walaupun toleransi lipatan RBD dan pertalian ACE2 yang agak baik.
(A) Dengan kehadiran antibodi, Regeneron menggunakan pseudotype panicle VSV untuk memilih mutasi melarikan diri virus dalam kultur sel (12).(B) Gambar rajah melarikan diri, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1A, tetapi hanya menunjukkan mutasi yang boleh diakses oleh satu perubahan nukleotida dalam jujukan Wuhan-Hu-1.Bukan kelabu menunjukkan mutasi dalam kultur sel (merah), dan pesakit yang dijangkiti (biru) ), atau kedua-duanya (ungu).Rajah S5 menunjukkan graf ini, yang diwarnai oleh cara mutasi mempengaruhi pertalian ACE2 atau ungkapan RBD.(C) Kinetik mutasi RBD pada pesakit yang dirawat dengan REGN-COV2 pada hari ke-145 jangkitan (garisan menegak bertitik hitam).Kekerapan hubungan antara E484A dan F486I meningkat, tetapi kerana E484A bukanlah mutasi melarikan diri dalam angka kami, ia tidak ditunjukkan dalam panel lain.Lihat juga angka.S4.(D) Mutasi melarikan diri yang berlaku dalam kultur sel dan pesakit yang dijangkiti boleh diakses oleh nukleotida tunggal, dan pengikatan antibodi melarikan diri tidak menyebabkan sebarang kos besar kepada pertalian ACE2 [seperti yang diukur dengan kaedah paparan yis (7)].Setiap titik adalah mutasi, dan bentuk dan warnanya menunjukkan sama ada ia boleh diakses dan dipilih semasa pertumbuhan virus.Lebih banyak mata kanan pada paksi-x menunjukkan pelepasan pengikatan antibodi yang lebih kuat;titik yang lebih tinggi pada paksi-y menunjukkan pertalian ACE2 yang lebih tinggi.
Untuk menentukan sama ada Escape Atlas boleh menganalisis evolusi virus yang menjangkiti manusia, kami telah memeriksa data penjujukan mendalam daripada pesakit imunokompromi yang dijangkiti secara berterusan yang menerima REGN-COV2 pada hari ke-145 selepas diagnosis Rawatan COVID-19 (16).Rawatan lewat membolehkan populasi virus pesakit mengumpul kepelbagaian genetik, sebahagian daripadanya mungkin didorong oleh tekanan imun, kerana pesakit mempunyai tindak balas antibodi autoneutralizing yang lemah sebelum rawatan (16).Selepas pentadbiran REGN-COV2, kekerapan lima mutasi asid amino dalam RBD berubah dengan cepat (Rajah 2C dan Rajah S4).Peta melarikan diri kami menunjukkan bahawa tiga daripada mutasi ini melarikan diri dari REGN10933 dan satu melarikan diri dari REGN10987 (Rajah 2B).Perlu diingat bahawa selepas rawatan antibodi, tidak semua mutasi dipindahkan ke tapak tetap.Sebaliknya, terdapat kebangkitan dan kejatuhan persaingan (Rajah 2C).Corak ini telah diperhatikan dalam evolusi dalaman perumah adaptif virus lain (17, 18), mungkin disebabkan oleh persaingan antara tunggangan bebas genetik dan keturunan virus.Kedua-dua kuasa ini seolah-olah memainkan peranan pada pesakit dengan jangkitan berterusan (Rajah 2C dan Rajah S4C): E484A (bukan mutasi melarikan diri dalam rajah kami) dan F486I (melarikan diri REGN10933) menunggang bebas selepas rawatan, dan keturunan virus yang membawa N440D Dan Q493K (masing-masing melarikan diri REGN10987 dan REGN10933) mula-mula bersaing dengan mutan melarikan diri REGN10933 Y489H, dan kemudian bersaing dengan keturunan yang membawa E484A dan F486I dan Q493K.
Tiga daripada empat mutasi melarikan diri pada pesakit yang dirawat dengan REGN-COV2 tidak dikenal pasti dalam pemilihan kultur sel virus Regeneron (Rajah 2B), yang menggambarkan kelebihan peta lengkap.Pemilihan virus tidak lengkap kerana mereka hanya boleh mengenal pasti sebarang mutasi yang dipilih secara rawak dalam eksperimen kultur sel tertentu itu.Sebaliknya, peta lengkap menyatakan semua mutasi, yang mungkin termasuk mutasi yang disebabkan oleh sebab yang tidak berkaitan dengan rawatan, tetapi secara tidak sengaja menjejaskan pengikatan antibodi.
Sudah tentu, evolusi virus dipengaruhi oleh batasan fungsi dan tekanan untuk mengelakkan antibodi.Mutasi dan pesakit yang dipilih dalam kultur sel sentiasa memenuhi kriteria berikut: mereka melarikan diri dari pengikatan antibodi, boleh masuk melalui perubahan nukleotida tunggal, dan mempunyai sedikit atau tiada kos untuk pertalian ACE2 [melalui mutasi dalam sebelumnya yang dipaparkan menggunakan yis Pengimbasan pengukuran RBD (7 )] (Rajah 2D dan Rajah S5).Oleh itu, peta lengkap tentang cara mutasi mempengaruhi fenotip biokimia utama RBD (seperti ACE dan pengikatan antibodi) boleh digunakan untuk menilai kemungkinan laluan untuk evolusi virus.Satu kaveat ialah dalam jangka masa evolusi yang lebih panjang, seperti yang diperhatikan dalam imuniti virus dan pelepasan dadah, disebabkan oleh interaksi epistatik, ruang toleransi untuk mutasi mungkin berubah (19-21).
Peta lengkap membolehkan kami menilai mutasi pelarian sedia ada dalam penyebaran SARS-CoV-2.Kami menyemak semua jujukan SARS-CoV-2 terbitan manusia yang tersedia pada 11 Januari 2021 dan mendapati bahawa sejumlah besar mutasi RBD terlepas daripada satu atau lebih antibodi (Rajah 3).Walau bagaimanapun, satu-satunya mutasi melarikan diri yang terdapat dalam >0.1% daripada jujukan ialah REGN10933 mutan melarikan diri Y453F [0.3% daripada jujukan;lihat (12)], REGN10987 melarikan diri mutan N439K [1.7% daripada jujukan;lihat Rajah 1C dan (22)], Dan LY-CoV016 melarikan diri mutasi K417N (jujukan 0.1%; lihat juga Rajah 1C).Y453F dikaitkan dengan wabak bebas yang berkaitan dengan ladang cerpelai di Belanda dan Denmark (23, 24);perlu diperhatikan bahawa jujukan cerpelai itu sendiri kadangkala mengandungi mutasi melarikan diri lain, seperti F486L (24).N439K sangat popular di Eropah, dan membentuk sebahagian besar jujukan dari Scotland dan Ireland di Eropah (22, 25).K417N wujud dalam keturunan B.1.351 yang pertama kali ditemui di Afrika Selatan (10).Satu lagi mutasi yang menjadi kebimbangan semasa ialah N501Y, yang terdapat dalam B.1.351 dan juga dalam keturunan B.1.1.7 yang pada asalnya dikenal pasti di UK (9).Peta kami menunjukkan bahawa N501Y tidak mempunyai kesan pada antibodi REGN-COV2, tetapi hanya kesan sederhana pada LY-CoV016 (Rajah 3).
Bagi setiap kombinasi antibodi atau antibodi, setakat 11 Januari 2021, antara 317,866 jujukan SARS-CoV-2 berkualiti tinggi yang diperoleh manusia pada GISAID (26), hubungan antara skor melarikan diri untuk setiap mutasi dan kekerapannya .Ia ditandakan.Mutasi melarikan diri koktel REGN-COV2 E406W memerlukan berbilang perubahan nukleotida dalam jujukan RBD Wuhan-Hu-1 dan tidak diperhatikan dalam jujukan GISAID.Mutasi lain sisa E406 (E406Q dan E406D) diperhatikan dengan pengiraan frekuensi rendah, tetapi asid amino mutan ini bukanlah mutasi nukleotida tunggal yang jauh dari W.
Seperti yang dijangkakan, mutasi melarikan diri biasanya berlaku dalam antara muka antibodi-RBD.Walau bagaimanapun, struktur sahaja tidak mencukupi untuk meramalkan mutasi mana yang menjadi pengantara melarikan diri.Sebagai contoh, LY-CoV016 menggunakan rantai berat dan ringannya untuk mengikat epitop yang luas yang bertindih dengan permukaan pengikatan ACE2, tetapi proses pelarian melibatkan mutasi dalam sisa RBD dalam rantau penentu pelengkap rantai berat (Rajah 4A dan Rajah S6, E hingga G).Sebaliknya, pelarian dari REGN10933 dan REGN10987 terutamanya berlaku pada residu RBD yang disusun pada antara muka rantai berat dan ringan antibodi (Rajah 4A dan Rajah S6, A hingga D).Mutasi E406W yang terlepas daripada campuran REGN-COV2 berlaku pada sisa yang tidak bersentuhan dengan mana-mana antibodi (Rajah 4, A dan B).Walaupun E406 secara struktur lebih hampir kepada LY-CoV016 (Rajah 4B dan Rajah S6H), mutasi E406W mempunyai kesan yang lebih kecil pada antibodi (Rajah 1, B dan C), menunjukkan bahawa mekanisme struktur jarak jauh tertentu adalah anti-REGN - Antibodi COV2 (Rajah S6I).Ringkasnya, mutasi pada residu RBD yang bersentuhan dengan antibodi tidak selalu menjadi pengantara melarikan diri, dan beberapa mutasi melarikan diri yang ketara berlaku pada residu yang tidak bersentuhan dengan antibodi (Rajah 4B dan Rajah S6, D dan G).
(A) Gambar rajah melarikan diri yang diunjurkan pada struktur RBD yang diikat oleh antibodi.[REGN10933 dan REGN10987: Pangkalan Data Protein (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: ID PDB 7C01 (13)].Domain pembolehubah rantai berat dan ringan antibodi ditunjukkan sebagai kartun biru, dan warna pada permukaan RBD menunjukkan kekuatan pelarian pengantara mutasi di tapak ini (putih menunjukkan tiada pelarian, dan merah menunjukkan paling kuat. tapak melarikan diri antibodi atau campuran) .Tapak yang tidak bermutasi berfungsi akan dikelabukan.(B) Bagi setiap antibodi, kelaskan tapak sebagai sentuhan antibodi langsung (atom bukan hidrogen dalam 4Å antibodi), antibodi proksimal (4 hingga 8Å) atau antibodi distal (> 8Å).Setiap titik mewakili tapak, dibahagikan kepada melarikan diri (merah) atau tidak melarikan diri (hitam).Garis putus-putus kelabu mewakili nilai kritikal yang digunakan untuk mengklasifikasikan tapak sebagai melarikan diri atau bukan melarikan diri (untuk butiran, lihat Bahan dan Kaedah).Nombor merah dan hitam menunjukkan bilangan tapak dalam setiap kategori yang dilarikan atau tidak dilepaskan.
Dalam kajian ini, kami telah memetakan sepenuhnya mutasi yang mengelak daripada tiga antibodi anti-SARS-CoV-2 utama.Peta ini menunjukkan bahawa pencirian mutasi melarikan diri sebelum ini tidak lengkap.Tiada mutasi asid amino tunggal yang boleh melarikan diri daripada dua antibodi dalam koktel REGN-COV2 telah dikenal pasti, dan mereka juga tidak mengenal pasti majoriti pesakit jangkitan berterusan yang dirawat dengan koktel.mutasi.Sudah tentu, peta kami belum lagi menjawab soalan yang paling mendesak: Adakah SARS-CoV-2 akan membangunkan rintangan yang meluas terhadap antibodi ini?Tetapi apa yang pasti adalah bahawa ia membimbangkan bahawa begitu banyak mutasi melarikan diri mempunyai sedikit kesan pada lipatan RBD atau pertalian reseptor, dan sudah terdapat beberapa mutasi tahap rendah dalam virus yang beredar.Pada akhirnya, adalah perlu untuk menunggu dan memerhatikan apakah mutasi yang akan dihantar oleh SARS-CoV-2 apabila ia merebak di kalangan penduduk.Kerja kami akan membantu "pemerhatian" dengan segera menerangkan kesan mutasi yang diklasifikasikan oleh pengawasan genom virus.
Ini ialah artikel akses terbuka yang diedarkan di bawah syarat Lesen Atribusi Creative Commons.Artikel itu membenarkan penggunaan, pengedaran dan pengeluaran semula tanpa had dalam mana-mana medium di bawah syarat bahawa karya asal dipetik dengan betul.
Nota: Kami hanya meminta anda memberikan alamat e-mel anda supaya orang yang anda cadangkan ke halaman itu tahu bahawa anda mahu mereka melihat e-mel itu dan ia bukan spam.Kami tidak akan menangkap sebarang alamat e-mel.
Soalan ini digunakan untuk menguji sama ada anda seorang pelawat dan menghalang penyerahan spam automatik.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Peta lengkap mutasi SARS-CoV-2 yang terlepas daripada campuran antibodi monoklonal Regeneron membantu menjelaskan evolusi virus dalam merawat pesakit.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Peta lengkap mutasi SARS-CoV-2 yang terlepas daripada campuran antibodi monoklonal Regeneron membantu menjelaskan evolusi virus dalam merawat pesakit.
©2021 American Association for the Advancement of Science.hak cipta terpelihara.AAAS ialah rakan kongsi HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Masa siaran: 24-Feb-2021