Verschillende antilichamen zijn al in gebruik of in ontwikkeling als therapieën voor de behandeling van COVID-19.Met de opkomst van nieuwe varianten van het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is het belangrijk om te voorspellen of deze nog steeds vatbaar zullen zijn voor antilichaamtherapie.Starr et al.Er werd gebruik gemaakt van een gistbibliotheek, die alle mutaties in het SARS-CoV-2-receptorbindende domein omvat die de binding aan de gastheerreceptor (ACE2) niet sterk zullen verstoren, en in kaart brengen hoe deze mutaties de drie beïnvloeden. -2 antilichaambinding.Deze cijfers identificeren mutaties die aan antilichaambinding ontsnappen, inclusief enkele mutaties die ontsnappen aan de twee antilichamen in de Regeneron-antilichaammix.Veel mutaties die aan een enkel antilichaam ontsnappen, verspreiden zich onder mensen.
Antilichamen zijn een potentiële therapie voor de behandeling van het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), maar het is niet duidelijk of het virus zich ontwikkelt om aan hun risico te ontsnappen.Hier brengen we in kaart hoe alle mutaties in het SARS-CoV-2-receptorbindende domein (RBD) de binding van de REGN-COV2-cocktail aan het antilichaam LY-CoV016 beïnvloeden.Deze volledige kaarten onthulden een aminozuurmutatie die het REGN-COV2-mengsel volledig omzeilde, dat is samengesteld uit twee antilichamen REGN10933 en REGN10987 die zich richten op verschillende structurele epitopen.Deze cijfers identificeren ook virusmutaties die zijn geselecteerd bij persistent geïnfecteerde patiënten die zijn behandeld met REGN-COV2 en tijdens in vitro virusontsnappingsselectie.Ten slotte laten deze cijfers zien dat mutaties die aan een enkel antilichaam ontsnappen, al aanwezig zijn in circulerende SARS-CoV-2-stammen.Deze volledige ontsnappingskaarten kunnen de gevolgen verklaren van mutaties die zijn waargenomen tijdens virussurveillance.
Er worden antilichamen ontwikkeld voor de behandeling van het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (1).Antilichamen tegen bepaalde andere virussen kunnen ineffectief worden gemaakt door virusmutaties die worden geselecteerd tijdens de behandeling van geïnfecteerde patiënten (2, 3) of door virale mutaties die zich wereldwijd hebben verspreid en resistentie tegen de gehele virusclade verlenen.Daarom is het van cruciaal belang om te bepalen welke SARS-CoV-2-mutaties kunnen ontsnappen aan belangrijke antilichamen om te beoordelen hoe mutaties die tijdens virussurveillance worden waargenomen, de effectiviteit van antilichaamtherapie beïnvloeden.
De meeste toonaangevende anti-SARS-CoV-2-antilichamen richten zich op het virale receptorbindende domein (RBD), dat de binding aan de angiotensine-converterend enzym 2-receptor (ACE2) medieert (5, 6).Onlangs hebben we een diepgaande mutatiescanmethode ontwikkeld om in kaart te brengen hoe alle mutaties van RBD de functie en herkenning ervan door antivirale antilichamen beïnvloeden (7, 8).De methode omvat het creëren van een bibliotheek van RBD-mutanten, deze tot expressie brengen op het oppervlak van gist, en het gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering en diepe sequencing om te kwantificeren hoe elke mutatie de RBD-vouwing, ACE2-affiniteit (gemeten in een titratiereeks) en antilichaambinding beïnvloedt. (Figuur S1A).In deze studie hebben we de repetitieve mutantenbibliotheek gebruikt die wordt beschreven in (7), die is samengesteld uit RBD-varianten met streepjescode, die 3804 van de 3819 mogelijke aminozuurmutaties omvat.Onze bibliotheek werd samengesteld op basis van de genetische achtergrond van RBD van het vroege isolaat Wuhan-Hu-1.Hoewel de frequentie van verschillende mutanten toeneemt, vertegenwoordigen ze nog steeds de meest voorkomende RBD-sequenties (9, 10).We hebben twee van de 2034 mutaties getekend die de RBD-vouwing en ACE-binding niet sterk verstoren (7), hoe de REGN-COV2-cocktail (REGN10933 en REGN10987) (11, 12) en Eli Lilly's LY-CoV016 door te geven. De recombinante vorm van de antilichaam beïnvloedt de methode van binding van antilichaam (ook wel CB6 of JS016 genoemd) (13) (Figuur S1B).REGN-COV2 heeft onlangs een autorisatie voor gebruik in noodgevallen gekregen voor COVID-19 (14), terwijl LY-CoV016 momenteel fase 3 klinische onderzoeken ondergaat (15).
[Glu406 → Trp (E406W)] ontsnapte sterk aan het mengsel van twee antilichamen (Figuur 1A).De ontsnappingskaart van LY-CoV016 onthulde ook veel ontsnappingsmutaties op verschillende locaties in RBD (Figuur 1B).Hoewel sommige ontsnappingsmutaties het vermogen van RBD om aan ACE2 te binden of in een op de juiste manier gevouwen vorm tot expressie te brengen kunnen aantasten, hebben veel functionele mutaties volgens eerdere metingen van diepe mutatiescanning met behulp van in gist weergegeven RBD weinig of geen effect op deze functionele eigenschappen (7). ) (Figuur 1, A en B vertegenwoordigen het verlies van ACE2-affiniteit, terwijl Figuur S2 de afname in RBD-expressie vertegenwoordigt.
(A) Het in kaart brengen van het antilichaam in REGN-COV2.Het lijndiagram aan de linkerkant toont de ontsnapping op elke locatie in het SGD (de som van alle mutaties op elke locatie).De logoafbeelding rechts toont de sterke ontsnappingslocatie (paarse onderstreping).De hoogte van elke letter is evenredig met de sterkte van de ontsnapping die wordt gemedieerd door de aminozuurmutatie, en een “ontsnappingsscore” van 1 voor elke mutatie komt overeen met een volledige ontsnapping.De schaal van de y-as is voor elke rij anders, dus E406W ontsnapt bijvoorbeeld aan alle REGN-antilichamen, maar dit is het meest voor de hand liggend voor cocktails omdat deze wordt overweldigd door de andere ontsnappingsplaatsen van individuele antilichamen.Voor de schaalbare versie worden S2, A en B gebruikt om de kaart in te kleuren op basis van de manier waarop mutaties de expressie van gevouwen RBD beïnvloeden.S2, C en D worden gebruikt om de invloed op de ACE2-affiniteit en RBD-expressie te verdelen over alle mutaties die worden waargenomen in circulerende virusisolaten.(B) Teken LY-CoV016, zoals weergegeven in (A).(C) Gebruik spike-pseudogetypeerde lentivirale deeltjes om belangrijke mutaties in de neutralisatietest te verifiëren.We hebben ervoor gekozen om de mutaties te verifiëren waarvan wordt voorspeld dat ze een grotere impact hebben of met een hoge frequentie voorkomen in SARS-CoV-2-isolaten (zoals N439K) in de bloedsomloop.Elk punt vertegenwoordigt de maalvoudige toename van de mediane remmende concentratie (IC50) van de mutatie ten opzichte van de piek van het ongemuteerde wildtype (WT) dat D614G bevat.De blauwe stippellijn 1 vertegenwoordigt een neutralisatie-effect vergelijkbaar met WT, en een waarde> 1 vertegenwoordigt een verhoogde neutralisatieweerstand.De kleur van de stip geeft aan of je van de kaart wilt ontsnappen.De stippen geven aan dat, aangezien de IC50 buiten de gebruikte verdunningsreeks ligt, de meervoudige verandering wordt gecontroleerd (boven- of ondergrens).De meeste mutanten worden in tweevoud getest, dus er zijn twee punten.De volledige neutralisatiecurve wordt weergegeven in figuur 2. S3.De afkortingen van één letter van aminozuurresiduen zijn als volgt: A, Ala;C, cysteïne;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, zijn;ik, Ile;K, lysine;L, Liu;Metropool N, Assen;P, Pro;Q, Gin;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, tryptofaan;en Y, Tyr.
Om het antigene effect van sleutelmutaties te verifiëren, voerden we een neutralisatietest uit met behulp van pluimvormige pseudogetypeerde lentivirale deeltjes, en ontdekten dat er een consistentie was tussen de antilichaambindende ontsnappingskaart en de neutralisatietest (Figuur 1C en Figuur S3).Zoals verwacht op basis van de REGN-COV2-antilichaamkaart, wordt de mutatie op positie 486 alleen geneutraliseerd door REGN10933, terwijl de mutatie op posities 439 en 444 alleen wordt geneutraliseerd door REGN10987, zodat deze mutaties niet kunnen ontsnappen.Maar E406W ontsnapte aan de twee REGN-COV2-antilichamen, dus ontsnapte het ook sterk aan het mengsel.Door structurele analyse en virus-ontsnappingsselectie gelooft Regeneron dat geen enkele aminozuurmutatie aan de twee antilichamen in de cocktail kan ontsnappen (11, 12), maar onze volledige kaart identificeert E406W als een cocktail-ontsnappingsmutatie.E406W beïnvloedt het REGN-COV2-antilichaam op een relatief specifieke manier en interfereert niet ernstig met de functie van RBD, omdat het het neutralisatie-effect van LY-CoV016 (Figuur 1C) en de titer van verrijkte pseudogetypeerde lentivirale deeltjes slechts in geringe mate vermindert (Figuur 1C). S3F).
Om te onderzoeken of onze ontsnappingskaart consistent is met de evolutie van virussen onder antilichaamselectie, hebben we eerst de gegevens gecontroleerd van het Regeneron-virus-ontsnappingsselectie-experiment, waarbij de expressiepiek werd gekweekt in celcultuur in de aanwezigheid van REGN10933. stomatitisvirus (VSV), REGN10987 of REGN-COV2-cocktail (12).Dit werk identificeerde vijf ontsnappingsmutaties uit REGN10933, twee ontsnappingsmutaties uit REGN10987 en geen mutaties uit cocktail (Figuur 2A).De mutaties die door alle zeven celculturen zijn geselecteerd, worden gemarkeerd in onze ontsnappingskaart, en de verandering van één nucleotide van het wildtype codon in de Wuhan-Hu-1 RBD-sequentie is ook toegankelijk (Figuur 2B), wat het verschil tussen ontsnappingen aangeeft. grafiek en virusevolutie onder antilichaamdruk in celcultuur.Het is vermeldenswaard dat E406W niet toegankelijk is via veranderingen in enkele nucleotiden, wat zou kunnen verklaren waarom de Regeneron-cocktailselectie het niet kan identificeren ondanks de relatief goede tolerantie voor RBD-vouwing en ACE2-affiniteit.
(A) In aanwezigheid van antilichamen gebruikt Regeneron pluimveepseudotype VSV om virusontsnappingsmutaties in celkweek te selecteren (12).(B) Het ontsnappingsdiagram, zoals weergegeven in figuur 1A, maar toont alleen de mutaties die toegankelijk zijn via een enkele nucleotideverandering in de Wuhan-Hu-1-sequentie.Niet-grijs duidt op mutaties in celcultuur (rood) en geïnfecteerde patiënten (blauw)), of beide (paars).Figuur S5 toont deze grafieken, die zijn gekleurd door de manier waarop mutaties de ACE2-affiniteit of RBD-expressie beïnvloeden.(C) Kinetiek van RBD-mutatie bij patiënten die werden behandeld met REGN-COV2 op de 145e dag van infectie (zwarte stippellijn).De frequentie van koppeling tussen E484A en F486I nam toe, maar aangezien E484A in onze figuur geen ontsnappingsmutatie is, wordt deze niet weergegeven in andere panelen.Zie ook figuur.S4.(D) De ontsnappingsmutaties die voorkomen in celkweek en geïnfecteerde patiënten zijn toegankelijk via een enkel nucleotide, en de binding van ontsnappingsantilichamen veroorzaakt geen grote kosten voor de ACE2-affiniteit [zoals gemeten met de gistweergavemethode (7)].Elk punt is een mutatie, en de vorm en kleur geven aan of het toegankelijk en geselecteerd kan worden tijdens de virusgroei.Hoe meer punten naar rechts op de x-as wijzen op een sterkere ontsnapping aan antilichaambinding;de hogere punten op de y-as duiden op een hogere ACE2-affiniteit.
Om te bepalen of Escape Atlas de evolutie van virussen die mensen infecteren kan analyseren, hebben we deep sequencing-gegevens onderzocht van een persistent geïnfecteerde immuungecompromitteerde patiënt die REGN-COV2 ontving op de 145e dag na de diagnose van de COVID-19-behandeling (16).Door een late behandeling kan de virale populatie van de patiënt genetische diversiteit accumuleren, waarvan een deel kan worden veroorzaakt door immuunstress, omdat de patiënt vóór de behandeling een zwakke autoneutraliserende antilichaamrespons heeft (16).Na toediening van REGN-COV2 veranderde de frequentie van vijf aminozuurmutaties in RBD snel (Figuur 2C en Figuur S4).Onze ontsnappingskaart liet zien dat drie van deze mutaties aan REGN10933 ontsnapten en één aan REGN10987 (Figuur 2B).Het is vermeldenswaard dat na de antilichaambehandeling niet alle mutaties naar de vaste plaats werden overgebracht.Integendeel, er is sprake van opkomst en ondergang van concurrentie (Figuur 2C).Dit patroon is waargenomen in de interne evolutie van de adaptieve gastheren van andere virussen (17, 18), mogelijk als gevolg van concurrentie tussen genetische meeliftende en virale lijnen.Beide krachten lijken een rol te spelen bij patiënten met een aanhoudende infectie (Figuur 2C en Figuur S4C): E484A (geen ontsnappingsmutatie in ons diagram) en F486I (ontsnapping REGN10933) die na behandeling meeliften, en viruslijnen die N440D dragen. Q493K (ontsnappen aan respectievelijk REGN10987 en REGN10933) concurreerde eerst met REGN10933-ontsnappingsmutant Y489H, en concurreerde vervolgens met de lijn die E484A en F486I en Q493K droeg.
Drie van de vier ontsnappingsmutaties bij patiënten die met REGN-COV2 werden behandeld, werden niet geïdentificeerd in de viruscelcultuurselectie van Regeneron (Figuur 2B), wat het voordeel van de volledige kaart illustreert.De virusselectie is onvolledig omdat ze alleen mutaties kunnen identificeren die willekeurig zijn geselecteerd in dat specifieke celcultuurexperiment.Integendeel, de volledige kaart annoteert alle mutaties, waaronder mogelijk mutaties die worden veroorzaakt door redenen die geen verband houden met de behandeling, maar die per ongeluk de antilichaambinding beïnvloeden.
Uiteraard wordt de evolutie van virussen beïnvloed door functionele beperkingen en de druk om antilichamen te omzeilen.De in de celcultuur geselecteerde mutaties en patiënten voldoen altijd aan de volgende criteria: ze ontsnappen aan antilichaambinding, kunnen binnenkomen via een enkele nucleotideverandering en hebben weinig of geen kosten voor de ACE2-affiniteit [door de eerdere diepe mutaties weergegeven met behulp van gist Scanning-meting RBD (7 )] (Figuur 2D en Figuur S5).Daarom kan een volledige kaart van hoe mutaties belangrijke biochemische fenotypes van RBD beïnvloeden (zoals ACE en antilichaambinding) worden gebruikt om mogelijke routes voor virusevolutie te beoordelen.Eén kanttekening is dat in een langer evolutionair tijdsbestek, zoals waargenomen bij virale immuniteit en het ontsnappen aan medicijnen, als gevolg van epistatische interacties de tolerantieruimte voor mutaties kan veranderen (19-21).
Met de volledige kaart kunnen we de bestaande ontsnappingsmutaties in het circulerende SARS-CoV-2 evalueren.We hebben alle beschikbare, van mensen afgeleide SARS-CoV-2-sequenties per 11 januari 2021 gecontroleerd en ontdekten dat een groot aantal RBD-mutaties aan een of meer antilichamen ontsnapten (Figuur 3).De enige ontsnappingsmutatie die aanwezig is in >0,1% van de sequentie is echter REGN10933-ontsnappingsmutant Y453F [0,3% van de sequentie;zie (12)], REGN10987 ontsnapt aan mutant N439K [1,7% van de sequentie;zie Figuur 1C en (22)], en LY-CoV016 ontsnapt aan mutatie K417N (0,1% sequentie; zie ook Figuur 1C).Y453F wordt in verband gebracht met onafhankelijke uitbraken gerelateerd aan nertsenhouderijen in Nederland en Denemarken (23, 24);het is vermeldenswaard dat de nertssequentie zelf soms andere ontsnappingsmutaties bevat, zoals F486L (24).N439K is erg populair in Europa en vormt een groot deel van de reeks uit Schotland en Ierland in Europa (22, 25).K417N bestaat in de B.1.351-lijn die voor het eerst werd ontdekt in Zuid-Afrika (10).Een andere mutatie die momenteel zorgwekkend is, is N501Y, die aanwezig is in B.1.351 en ook in de B.1.1.7-lijn die oorspronkelijk in Groot-Brittannië werd geïdentificeerd (9).Onze kaart laat zien dat N501Y geen effect heeft op REGN-COV2-antilichaam, maar slechts een matig effect op LY-CoV016 (Figuur 3).
Voor elk antilichaam of antilichaamcombinatie, vanaf 11 januari 2021, onder de 317.866 hoogwaardige, van mensen afgeleide SARS-CoV-2-sequenties op GISAID (26), is de relatie tussen de ontsnappingsscore voor elke mutatie en de frequentie ervan .Het is gemarkeerd.De REGN-COV2-cocktail-ontsnappingsmutatie E406W vereist meerdere nucleotideveranderingen in de Wuhan-Hu-1 RBD-sequentie en wordt niet waargenomen in de GISAID-sequentie.Andere mutaties van residu E406 (E406Q en E406D) werden waargenomen met lage frequentietellingen, maar deze mutante aminozuren zijn geen enkelvoudige nucleotidemutaties ver weg van W.
Zoals verwacht treden ontsnappingsmutaties meestal op in het grensvlak tussen antilichaam en RBD.Structuur alleen is echter niet voldoende om te voorspellen welke mutaties ontsnapping bemiddelen.LY-CoV016 gebruikt bijvoorbeeld zijn zware en lichte ketens om te binden aan een brede epitoop die het ACE2-bindingsoppervlak overlapt, maar het ontsnappingsproces omvat mutaties in RBD-residuen in het complementariteitsbepalende gebied van de zware keten (Figuur 4A en Figuur S6, E tot en met G).Daarentegen vonden ontsnappingen uit REGN10933 en REGN10987 voornamelijk plaats bij de RBD-residuen gestapeld op het grensvlak van zware en lichte ketens van antilichamen (Figuur 4A en Figuur S6, A tot D).De E406W-mutatie die aan het REGN-COV2-mengsel ontsnapte, vond plaats bij residuen die niet in contact waren met beide antilichamen (Figuur 4, A en B).Hoewel E406 structureel dichter bij LY-CoV016 ligt (Figuur 4B en Figuur S6H), heeft de E406W-mutatie een veel kleiner effect op het antilichaam (Figuur 1, B en C), wat erop wijst dat het specifieke structurele langetermijnmechanisme anti-REGN is. - COV2-antilichaam (Figuur S6I).Samenvattend zorgen mutaties bij RBD-residuen die in contact komen met antilichamen niet altijd voor ontsnapping, en enkele significante ontsnappingsmutaties treden op bij residuen die niet in contact staan met antilichamen (Figuur 4B en Figuur S6, D en G).
(A) Het ontsnappingsdiagram geprojecteerd op de RBD-structuur gebonden door het antilichaam.[REGN10933 en REGN10987: Eiwitdatabase (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: VOB-ID 7C01 (13)].De variabele domeinen van de zware en lichte ketens van het antilichaam worden weergegeven als blauwe cartoons, en de kleur op het oppervlak van de RBD geeft de sterkte aan van de door mutatie gemedieerde ontsnapping op deze plaats (wit geeft aan dat er geen ontsnapping is en rood geeft de sterkste aan). ontsnappingsplaats van het antilichaam of mengsel).Sites die niet functioneel zijn gemuteerd, worden grijs weergegeven.(B) Classificeer voor elk antilichaam de plaats als direct antilichaamcontact (niet-waterstofatomen binnen 4 A van het antilichaam), proximaal antilichaam (4 tot 8 A) of distaal antilichaam (> 8 A).Elk punt vertegenwoordigt een locatie, verdeeld in ontsnapping (rood) of niet-ontsnapping (zwart).De grijze stippellijn vertegenwoordigt de kritische waarde die wordt gebruikt om de locatie te classificeren als ontsnapping of niet-ontsnapping (voor details, zie Materialen en methoden).De rode en zwarte cijfers geven aan hoeveel sites in elke categorie zijn ontsnapt of niet zijn ontsnapt.
In deze studie hebben we de mutaties die de drie belangrijkste anti-SARS-CoV-2-antilichamen omzeilen, volledig in kaart gebracht.Deze kaarten geven aan dat de eerdere karakterisering van ontsnappingsmutaties onvolledig is.Er zijn geen enkele aminozuurmutaties geïdentificeerd die aan de twee antilichamen in de REGN-COV2-cocktail kunnen ontsnappen, noch hebben ze de meerderheid van de patiënten met aanhoudende infecties geïdentificeerd die met de cocktail zijn behandeld.mutatie.Natuurlijk heeft onze kaart de meest prangende vraag nog niet beantwoord: zal SARS-CoV-2 uitgebreide resistentie tegen deze antilichamen ontwikkelen?Maar wat zeker is, is dat het zorgwekkend is dat zoveel ontsnappingsmutaties weinig effect hebben op de RBD-vouwing of receptoraffiniteit, en dat er al enkele mutaties op laag niveau zijn in circulerende virussen.Uiteindelijk is het noodzakelijk om af te wachten en te observeren welke mutaties SARS-CoV-2 zal overbrengen wanneer het zich onder de bevolking verspreidt.Ons werk zal de ‘observatie’ bevorderen door onmiddellijk de impact uit te leggen van mutaties die zijn geclassificeerd door virale genoomsurveillance.
Dit is een open access-artikel dat wordt verspreid onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License.Het artikel staat onbeperkt gebruik, distributie en reproductie op elk medium toe, op voorwaarde dat het originele werk correct wordt geciteerd.
Opmerking: we vragen u alleen om uw e-mailadres op te geven, zodat de persoon die u aanbeveelt op de pagina weet dat u wilt dat hij of zij de e-mail ziet en dat deze geen spam is.Wij zullen geen e-mailadressen vastleggen.
Deze vraag wordt gebruikt om te testen of u een bezoeker bent en om automatische spamverzending te voorkomen.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
De volledige kaart van SARS-CoV-2-mutaties die ontsnappen aan het Regeneron-monoklonale antilichaammengsel helpt de evolutie van het virus bij de behandeling van patiënten te verklaren.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
De volledige kaart van SARS-CoV-2-mutaties die ontsnappen aan het Regeneron-monoklonale antilichaammengsel helpt de evolutie van het virus bij de behandeling van patiënten te verklaren.
©2021 Amerikaanse Vereniging voor de Bevordering van de Wetenschap.alle rechten voorbehouden.AAAS is een partner van HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Posttijd: 24 februari 2021