Flere antistoffer er allerede i bruk eller under utvikling som terapier for behandling av COVID-19.Med fremveksten av nye varianter av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), er det viktig å forutsi om de fortsatt vil være mottakelige for antistoffbehandling.Starr et al.Det ble brukt et gjærbibliotek som dekker alle mutasjoner i SARS-CoV-2-reseptorbindingsdomenet som ikke vil sterkt forstyrre bindingen til vertsreseptoren (ACE2), og kartlegge hvordan disse mutasjonene påvirker de tre hovedanti-SARS-CoV -2 antistoffbinding.Disse figurene identifiserer mutasjoner som unnslipper antistoffbinding, inkludert enkeltmutasjoner som unnslipper de to antistoffene i Regeneron-antistoffblandingen.Mange mutasjoner som unnslipper et enkelt antistoff sprer seg i mennesker.
Antistoffer er en potensiell terapi for behandling av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), men det er ikke klart at viruset utvikler seg for å unnslippe risikoen.Her kartlegger vi hvordan alle mutasjoner i SARS-CoV-2-reseptorbindende domene (RBD) påvirker bindingen av REGN-COV2-cocktailen til antistoffet LY-CoV016.Disse komplette kartene avslørte en aminosyremutasjon som fullstendig unngikk REGN-COV2-blandingen, som er sammensatt av to antistoffer REGN10933 og REGN10987 som retter seg mot forskjellige strukturelle epitoper.Disse tallene identifiserer også virusmutasjoner selektert hos vedvarende infiserte pasienter behandlet med REGN-COV2 og under in vitro-virusutvalg.Til slutt avslører disse tallene at mutasjoner som unnslipper et enkelt antistoff allerede er tilstede i sirkulerende SARS-CoV-2-stammer.Disse fullstendige rømningskartene kan forklare konsekvensene av mutasjoner observert under virusovervåking.
Antistoffer utvikles for å behandle alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (1).Antistoffer mot visse andre virus kan gjøres ineffektive av virusmutasjoner valgt under behandling av infiserte pasienter (2, 3) eller virusmutasjoner som har spredt seg globalt for å gi resistens til hele viruskladen.Derfor er det avgjørende å bestemme hvilke SARS-CoV-2-mutasjoner som kan unnslippe nøkkelantistoffer for å vurdere hvordan mutasjoner observert under virusovervåking påvirker effektiviteten av antistoffterapi.
De fleste ledende anti-SARS-CoV-2-antistoffer retter seg mot det virale reseptorbindingsdomenet (RBD), som medierer binding til den angiotensinkonverterende enzym 2 (ACE2)-reseptoren (5, 6).Nylig har vi utviklet en dyp mutasjonsskanningsmetode for å kartlegge hvordan alle mutasjoner av RBD påvirker dens funksjon og gjenkjennelse av antivirale antistoffer (7, 8).Metoden innebærer å lage et bibliotek av RBD-mutanter, uttrykke dem på overflaten av gjær, og bruke fluorescensaktivert cellesortering og dypsekvensering for å kvantifisere hvordan hver mutasjon påvirker RBD-folding, ACE2-affinitet (målt i en titreringsserie) og antistoffbinding. (Figur S1A).I denne studien brukte vi det repeterende mutantbiblioteket beskrevet i (7), som er sammensatt av strekkodede RBD-varianter, som dekker 3804 av de 3819 mulige aminosyremutasjonene.Biblioteket vårt ble utarbeidet fra den genetiske RBD-bakgrunnen til det tidlige isolatet Wuhan-Hu-1.Selv om frekvensen av flere mutanter øker, representerer de fortsatt de vanligste RBD-sekvensene (9, 10).Vi har tegnet to av 2034 mutasjoner som ikke sterkt forstyrrer RBD-foldingen og ACE-bindingen (7) hvordan passerer REGN-COV2-cocktailen (REGN10933 og REGN10987) (11, 12) og Eli Lillys LY-CoV016 Den rekombinante formen av antistoff påvirker metoden for å binde antistoff (også kalt CB6 eller JS016) (13) (Figur S1B).REGN-COV2 ble nylig gitt en nødbruksautorisasjon for COVID-19 (14), mens LY-CoV016 for tiden gjennomgår kliniske fase 3-studier (15).
[Glu406→Trp(E406W)] slapp sterkt unna blandingen av to antistoffer (figur 1A).Rømningskartet til LY-CoV016 avslørte også mange rømningsmutasjoner på forskjellige steder i RBD (figur 1B).Selv om noen rømningsmutasjoner kan svekke evnen til RBD til å binde seg til ACE2 eller uttrykke seg i en passende foldet form, har mange funksjonelle mutasjoner liten eller ingen effekt på disse funksjonelle egenskapene i henhold til tidligere målinger av dyp mutasjonsskanning ved bruk av gjær-visert RBD (7 ) (Figur 1, A og B representerer tapet av ACE2-affinitet, mens figur S2 representerer reduksjonen i RBD-ekspresjon.
(A) Kartlegging av antistoffet i REGN-COV2.Linjegrafen til venstre viser rømningen på hvert sted i RBD (summen av alle mutasjoner på hvert sted).Logobildet til høyre viser det sterke rømningsstedet (lilla understreking).Høyden på hver bokstav er proporsjonal med styrken til rømmingen mediert av aminosyremutasjonen, og en "escape score" på 1 for hver mutasjon tilsvarer en fullstendig rømming.Skalaen på y-aksen er forskjellig for hver rad, så for eksempel unnslipper E406W alle REGN-antistoffer, men den er mest åpenbar for cocktailer fordi den er overveldet av de andre rømningsstedene til individuelle antistoffer.For den skalerbare versjonen brukes S2, A og B til å fargelegge kartet etter hvordan mutasjoner påvirker uttrykket av foldet RBD.S2, C og D brukes til å fordele påvirkningen på ACE2-affinitet og RBD-ekspresjon blant alle mutasjonene som er observert i sirkulerende virusisolater.(B) Som vist i (A), tegn LY-CoV016.(C) Bruk spike-pseudotype lentivirale partikler for å bekrefte nøkkelmutasjoner i nøytraliseringsanalysen.Vi valgte å verifisere mutasjonene som er spådd å ha større innvirkning eller eksisterer med høy frekvens i SARS-CoV-2-isolater (som N439K) i sirkulasjonen.Hvert punkt representerer den foldbare økningen av median hemmende konsentrasjon (IC50) av mutasjonen i forhold til toppen av den umuterte villtype (WT) som inneholder D614G.Den blå stiplede linjen 1 representerer en nøytraliseringseffekt som ligner på WT, og en verdi > 1 representerer en økt nøytraliseringsmotstand.Fargen på prikken indikerer om du vil rømme fra kartet.Prikkene indikerer at siden IC50 er utenfor fortynningsserien som brukes, kontrolleres den multiple endringen (øvre eller nedre grense).De fleste mutanter testes i duplikat, så det er to punkter.Den komplette nøytraliseringskurven er vist i figur 2. S3.En-bokstavsforkortelsene for aminosyrerester er som følger: A, Ala;C, cystein;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, hans;jeg, Ile;K, lysin;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gin;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, tryptofan;og Y, Tyr.
For å verifisere den antigene effekten av nøkkelmutasjoner, utførte vi en nøytraliseringsanalyse ved bruk av panikkpseudotype lentivirale partikler, og fant at det var en konsistens mellom antistoffbindende rømningskart og nøytraliseringsanalysen (figur 1C og figur S3).Som forventet fra REGN-COV2 antistoffkartet, nøytraliseres mutasjonen i posisjon 486 bare av REGN10933, mens mutasjonen i posisjonene 439 og 444 bare nøytraliseres av REGN10987, så disse mutasjonene kan ikke unnslippe.Men E406W slapp unna de to REGN-COV2-antistoffene, så den slapp også sterkt fra blandingen.Gjennom strukturell analyse og virusfluktseleksjon, mener Regeneron at ingen enkelt aminosyremutasjon kan unnslippe de to antistoffene i cocktailen (11, 12), men vårt komplette kart identifiserer E406W som en cocktailfluktmutasjon.E406W påvirker REGN-COV2-antistoffet på en relativt spesifikk måte, og forstyrrer ikke seriøst funksjonen til RBD, fordi det bare reduserer nøytraliseringseffekten til LY-CoV016 (Figur 1C) og titeren til pseudotype lentivirale partikler (figur 1C) S3F).
For å undersøke om rømningskartet vårt stemmer overens med utviklingen av virus under antistoffseleksjon, sjekket vi først dataene fra Regeneron-virusutvelgelseseksperimentet, der ekspresjonspiken ble dyrket i cellekultur i nærvær av enhver REGN10933 The vesicular stomatittvirus (VSV), REGN10987 eller REGN-COV2 cocktail (12).Dette arbeidet identifiserte fem rømningsmutasjoner fra REGN10933, to rømningsmutasjoner fra REGN10987, og ingen mutasjoner fra cocktail (figur 2A).Mutasjonene valgt av alle de syv cellekulturene er fremhevet i rømningskartet vårt, og enkeltnukleotidendringen av villtypekodonet i Wuhan-Hu-1 RBD-sekvensen er også tilgjengelig (Figur 2B), noe som indikerer forskjellen mellom rømmingskonkordans graf og virusutvikling under antistofftrykk i cellekultur.Det er verdt å merke seg at E406W ikke kan nås med enkeltnukleotidendringer, noe som kan forklare hvorfor Regeneron-cocktailutvalget ikke kan identifisere det til tross for den relativt gode toleransen for RBD-folding og ACE2-affinitet.
(A) I nærvær av antistoffer bruker Regeneron panikkpseudotype VSV for å velge virusfluktmutasjoner i cellekultur (12).(B) Rømningsdiagrammet, som vist i figur 1A, men viser bare mutasjonene som er tilgjengelige ved en enkelt nukleotidendring i Wuhan-Hu-1-sekvensen.Ikke-grå indikerer mutasjoner i cellekultur (rød), og infiserte pasienter (blå) ), eller begge (lilla).Figur S5 viser disse grafene, som er farget av hvordan mutasjoner påvirker ACE2-affinitet eller RBD-uttrykk.(C) Kinetikk av RBD-mutasjon hos pasienter behandlet med REGN-COV2 på den 145. dagen av infeksjon (svart stiplet vertikal linje).Hyppigheten av kobling mellom E484A og F486I økte, men siden E484A ikke er en rømningsmutasjon i vår figur, er den ikke vist i andre paneler.Se også figur.S4.(D) Rømningsmutasjonene som oppstår i cellekultur og infiserte pasienter er tilgjengelige med et enkelt nukleotid, og bindingen av rømningsantistoffer forårsaker ingen store kostnader for ACE2-affinitet [målt ved gjærvisningsmetoden (7)].Hvert punkt er en mutasjon, og dets form og farge indikerer om det kan nås og velges under virusvekst.De mer høyre punktene på x-aksen indikerer sterkere antistoffbindingsutgang;de høyere punktene på y-aksen indikerer høyere ACE2-affinitet.
For å finne ut om Escape Atlas kan analysere utviklingen av virus som infiserer mennesker, undersøkte vi dypsekvenseringsdata fra en vedvarende infisert immunkompromittert pasient som mottok REGN-COV2 på den 145. dagen etter diagnosen COVID-19-behandling (16).Sen behandling lar pasientens viruspopulasjon akkumulere genetisk mangfold, hvorav noen kan være drevet av immunstress, fordi pasienten har en svak autonøytraliserende antistoffrespons før behandling (16).Etter administrering av REGN-COV2 endret frekvensen av fem aminosyremutasjoner i RBD seg raskt (Figur 2C og Figur S4).Vårt rømningskart viste at tre av disse mutasjonene slapp unna REGN10933 og en unnslapp REGN10987 (Figur 2B).Det er verdt å merke seg at etter antistoffbehandlingen ble ikke alle mutasjoner overført til det faste stedet.Tvert imot, det er økning og fall av konkurranse (Figur 2C).Dette mønsteret har blitt observert i den interne utviklingen av de adaptive vertene til andre virus (17, 18), muligens på grunn av konkurranse mellom genetisk frikjøring og virale avstamninger.Begge disse kreftene ser ut til å spille en rolle hos pasienter med vedvarende infeksjon (figur 2C og figur S4C): E484A (ikke en rømningsmutasjon i diagrammet vårt) og F486I (escape REGN10933) frikjøring etter behandling, og viruslinjer som bærer N440D og Q493K (unnslipper henholdsvis REGN10987 og REGN10933) konkurrerte først med REGN10933 rømningsmutant Y489H, og konkurrerte deretter med avstamningen som bar E484A og F486I og Q493K.
Tre av de fire rømningsmutasjonene hos pasienter behandlet med REGN-COV2 ble ikke identifisert i Regenerons viruscellekulturutvalg (Figur 2B), som illustrerer fordelen med det komplette kartet.Virusvalg er ufullstendig fordi de bare kan identifisere eventuelle mutasjoner som er tilfeldig valgt i det bestemte cellekultureksperimentet.Tvert imot merker det komplette kartet alle mutasjoner, som kan inkludere mutasjoner forårsaket av årsaker som ikke er relatert til behandling, men som ved et uhell påvirker antistoffbindingen.
Selvfølgelig er utviklingen av virus påvirket av funksjonelle begrensninger og press for å unngå antistoffer.Mutasjonene og pasientene som er valgt i cellekultur oppfyller alltid følgende kriterier: de slipper antistoffbinding, kan komme inn gjennom en enkelt nukleotidendring og har liten eller ingen kostnad for ACE2-affinitet [gjennom de tidligere dype mutasjonene vist ved bruk av gjær-skanning-måling RBD (7 )] (Figur 2D og Figur S5).Derfor kan et komplett kart over hvordan mutasjoner påvirker viktige biokjemiske fenotyper av RBD (som ACE og antistoffbinding) brukes til å vurdere mulige veier for virusutvikling.Et forbehold er at i en lengre evolusjonær tidsramme, som observert i viral immunitet og medikamentflukt, på grunn av epistatiske interaksjoner, kan toleranserommet for mutasjoner endres (19-21).
Det komplette kartet lar oss evaluere de eksisterende rømningsmutasjonene i den sirkulerende SARS-CoV-2.Vi sjekket alle tilgjengelige menneskeavledede SARS-CoV-2-sekvenser per 11. januar 2021 og fant at et stort antall RBD-mutasjoner slapp unna ett eller flere antistoffer (figur 3).Imidlertid er den eneste rømningsmutasjonen tilstede i >0,1 % av sekvensen REGN10933 rømningsmutant Y453F [0,3 % av sekvensen;se (12)], REGN10987 unnslippe mutant N439K [1,7% av sekvensen;se figur 1C og (22)], og LY-CoV016 unnslippe mutasjon K417N (0,1 % sekvens; se også figur 1C).Y453F er assosiert med uavhengige utbrudd relatert til minkfarmer i Nederland og Danmark (23, 24);det er verdt å merke seg at selve minksekvensen noen ganger inneholder andre rømningsmutasjoner, slik som F486L (24).N439K er svært populær i Europa, og utgjør en stor del av sekvensen fra Skottland og Irland i Europa (22, 25).K417N eksisterer i B.1.351-linjen som ble først oppdaget i Sør-Afrika (10).En annen mutasjon av aktuell bekymring er N501Y, som er tilstede i B.1.351 og også i B.1.1.7-linjen opprinnelig identifisert i Storbritannia (9).Kartet vårt viser at N501Y ikke har noen effekt på REGN-COV2-antistoff, men bare moderat effekt på LY-CoV016 (Figur 3).
For hver antistoff- eller antistoffkombinasjon, per 11. januar 2021, blant de 317 866 høykvalitets human-avledede SARS-CoV-2-sekvensene på GISAID (26), forholdet mellom rømningsskåren for hver mutasjon og dens frekvens.Det er merket.REGN-COV2 cocktailfluktmutasjonen E406W krever flere nukleotidendringer i Wuhan-Hu-1 RBD-sekvensen, og observeres ikke i GISAID-sekvensen.Andre mutasjoner av rest E406 (E406Q og E406D) ble observert med lavfrekvent telling, men disse mutante aminosyrene er ikke enkeltnukleotidmutasjoner langt unna W.
Som forventet forekommer rømningsmutasjoner vanligvis i antistoff-RBD-grensesnittet.Struktur alene er imidlertid ikke nok til å forutsi hvilke mutasjoner som formidler rømming.For eksempel bruker LY-CoV016 sine tunge og lette kjeder for å binde seg til en bred epitop som overlapper ACE2-bindingsoverflaten, men rømningsprosessen involverer mutasjoner i RBD-rester i den tungkjedekomplementaritetsbestemmende regionen (Figur 4A og Figur S6, E til G).I motsetning skjedde rømming fra REGN10933 og REGN10987 hovedsakelig ved RBD-restene stablet i grensesnittet mellom antistofftunge og lette kjeder (figur 4A og figur S6, A til D).E406W-mutasjonen som unnslapp REGN-COV2-blandingen skjedde ved rester som ikke var i kontakt med noen av antistoffene (figur 4, A og B).Selv om E406 er strukturelt nærmere LY-CoV016 (Figur 4B og Figur S6H), har E406W-mutasjonen en mye mindre effekt på antistoffet (Figur 1, B og C), noe som indikerer at den spesifikke langdistanse strukturelle mekanismen er anti-REGN - COV2-antistoff (Figur S6I).Oppsummert, mutasjoner ved RBD-rester i kontakt med antistoffer medierer ikke alltid rømming, og noen betydelige rømningsmutasjoner forekommer ved rester som ikke er i kontakt med antistoffer (Figur 4B og Figur S6, D og G).
(A) Rømningsdiagrammet projisert på RBD-strukturen bundet av antistoffet.[REGN10933 og REGN10987: Protein Database (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].De variable domenene til de tunge og lette kjedene til antistoffet er vist som blå tegneserier, og fargen på overflaten av RBD indikerer styrken til den mutasjonsmedierte rømningen på dette stedet (hvit indikerer ingen rømning, og rød indikerer den sterkeste rømningssted for antistoffet eller blandingen).Nettsteder som ikke er funksjonelt mutert er nedtonet.(B) For hvert antistoff, klassifiser stedet som direkte antistoffkontakt (ikke-hydrogenatomer innenfor 4Å av antistoffet), proksimalt antistoff (4 til 8Å) eller distalt antistoff (> 8Å).Hvert punkt representerer et sted, delt inn i escape (rød) eller non-escape (svart).Den grå stiplede linjen representerer den kritiske verdien som brukes til å klassifisere stedet som rømning eller ikke-rømning (for detaljer, se Materialer og metoder).De røde og svarte tallene indikerer hvor mange nettsteder i hver kategori som er escaped eller unescaped.
I denne studien har vi fullstendig kartlagt mutasjonene som unngår de tre store anti-SARS-CoV-2-antistoffene.Disse kartene indikerer at den tidligere karakteriseringen av rømningsmutasjoner er ufullstendig.Verken enkelt aminosyremutasjoner som kan unnslippe de to antistoffene i REGN-COV2-cocktailen er identifisert, og de har heller ikke identifisert flertallet av vedvarende infeksjonspasienter behandlet med cocktailen.mutasjon.Selvfølgelig har kartet vårt ennå ikke svart på det mest presserende spørsmålet: Vil SARS-CoV-2 utvikle omfattende resistens mot disse antistoffene?Men det som er sikkert er at det er bekymringsfullt at så mange rømningsmutasjoner har liten effekt på RBD-folding eller reseptoraffinitet, og det er allerede noen lavnivåmutasjoner i sirkulerende virus.Til slutt er det nødvendig å vente og observere hvilke mutasjoner SARS-CoV-2 vil overføre når den sprer seg blant befolkningen.Vårt arbeid vil hjelpe "observasjon" ved umiddelbart å forklare virkningen av mutasjoner klassifisert ved viral genomovervåking.
Dette er en åpen artikkel distribuert under vilkårene i Creative Commons Attribution License.Artikkelen tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium under forutsetning av at originalverket er korrekt sitert.
Merk: Vi ber deg kun oppgi e-postadressen din slik at personen du anbefaler til siden vet at du vil at de skal se e-posten og at det ikke er spam.Vi vil ikke fange opp noen e-postadresser.
Dette spørsmålet brukes til å teste om du er en besøkende og forhindre automatisk innsending av søppelpost.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Det komplette kartet over SARS-CoV-2-mutasjoner som unnslipper Regeneron monoklonale antistoffblanding hjelper til med å forklare utviklingen av viruset ved behandling av pasienter.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Det komplette kartet over SARS-CoV-2-mutasjoner som unnslipper Regeneron monoklonale antistoffblanding hjelper til med å forklare utviklingen av viruset ved behandling av pasienter.
©2021 American Association for the Advancement of Science.alle rettigheter forbeholdt.AAAS er partner av HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Innleggstid: 24. februar 2021