Kilka przeciwciał jest już w użyciu lub jest w fazie opracowywania jako terapie stosowane w leczeniu COVID-19.Wraz z pojawieniem się nowych wariantów wirusa 2 ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV-2) ważne jest przewidzenie, czy będą one nadal podatne na terapię przeciwciałami.Starr i in.Zastosowano bibliotekę drożdżową, która obejmuje wszystkie mutacje w domenie wiążącej receptor SARS-CoV-2, które nie zakłócają silnie wiązania z receptorem gospodarza (ACE2), i mapuje, jak te mutacje wpływają na trzy główne -2 wiązanie przeciwciał.Liczby te identyfikują mutacje, które wymykają się wiązaniu przeciwciał, w tym pojedyncze mutacje, które wymykają się dwóm przeciwciałom w mieszance przeciwciał Regeneron.Wiele mutacji, które wymykają się pojedynczemu przeciwciału, rozprzestrzenia się u ludzi.
Przeciwciała są potencjalną terapią w leczeniu koronaawirusa 2 ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV-2), ale nie jest jasne, czy wirus rozwija się, aby uniknąć związanego z nim ryzyka.Tutaj mapujemy, jak wszystkie mutacje w domenie wiążącej receptor SARS-CoV-2 (RBD) wpływają na wiązanie koktajlu REGN-COV2 z przeciwciałem LY-CoV016.Te kompletne mapy ujawniły mutację aminokwasu, która całkowicie ominęła mieszaninę REGN-COV2, która składa się z dwóch przeciwciał REGN10933 i REGN10987, które celują w różne epitopy strukturalne.Liczby te identyfikują również mutacje wirusa wybrane u trwale zakażonych pacjentów leczonych REGN-COV2 i podczas selekcji wirusa uciekającego in vitro.Wreszcie, liczby te pokazują, że mutacje, które wymykają się pojedynczemu przeciwciału, są już obecne w krążących szczepach SARS-CoV-2.Te kompletne mapy ucieczki mogą wyjaśnić konsekwencje mutacji zaobserwowanych podczas nadzoru wirusów.
Trwają prace nad przeciwciałami do leczenia wirusa ciężkiego ostrego zespołu oddechowego 2 (SARS-CoV-2) (1).Przeciwciała przeciwko niektórym innym wirusom mogą stać się nieskuteczne w wyniku mutacji wirusa wybranych podczas leczenia zakażonych pacjentów (2, 3) lub mutacji wirusa, które rozprzestrzeniły się po całym świecie, nadając oporność całemu kladowi wirusów.Dlatego określenie, które mutacje SARS-CoV-2 mogą uciec kluczowym przeciwciałom, ma kluczowe znaczenie dla oceny, w jaki sposób mutacje zaobserwowane podczas nadzoru nad wirusami wpływają na skuteczność terapii przeciwciałami.
Większość wiodących przeciwciał anty-SARS-CoV-2 celuje w domenę wiążącą receptor wirusa (RBD), która pośredniczy w wiązaniu się z receptorem enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2) (5, 6).Niedawno opracowaliśmy metodę głębokiego skanowania mutacji, aby mapować, jak wszystkie mutacje RBD wpływają na jego funkcję i rozpoznawanie przez przeciwciała przeciwwirusowe (7, 8).Metoda obejmuje utworzenie biblioteki mutantów RBD, ekspresję ich na powierzchni drożdży oraz wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją i głębokiego sekwencjonowania w celu ilościowego określenia, w jaki sposób każda mutacja wpływa na zwijanie RBD, powinowactwo ACE2 (mierzone w serii miareczkowania) i wiązanie przeciwciał (Rysunek S1A).W tym badaniu wykorzystaliśmy bibliotekę powtarzalnych mutantów opisaną w (7), która składa się z wariantów RBD z kodami kreskowymi, obejmujących 3804 z 3819 możliwych mutacji aminokwasów.Naszą bibliotekę przygotowano na podstawie tła genetycznego RBD wczesnego izolatu Wuhan-Hu-1.Chociaż częstotliwość występowania kilku mutantów rośnie, nadal reprezentują one najczęstsze sekwencje RBD (9, 10).Wylosowaliśmy dwie z 2034 mutacji, które nie zakłócają silnie fałdowania RBD i wiązania ACE (7), jak przekazać koktajl REGN-COV2 (REGN10933 i REGN10987) (11, 12) i LY-CoV016 firmy Eli Lilly. Rekombinowana forma przeciwciało wpływa na metodę wiązania przeciwciała (zwanego także CB6 lub JS016) (13) (Rysunek S1B).REGN-COV2 otrzymał niedawno zezwolenie na stosowanie w sytuacjach awaryjnych w leczeniu COVID-19 (14), natomiast LY-CoV016 przechodzi obecnie badania kliniczne 3. fazy (15).
[Glu406 → Trp(E406W)] silnie wymykał się mieszaninie dwóch przeciwciał (Figura 1A).Mapa ucieczki LY-CoV016 ujawniła również wiele mutacji ucieczki w różnych miejscach RBD (ryc. 1B).Chociaż niektóre mutacje ucieczki mogą osłabiać zdolność RBD do wiązania się z ACE2 lub ekspresji w odpowiednio złożonej formie, zgodnie z wcześniejszymi pomiarami głębokiego skanowania mutacji przy użyciu RBD wyświetlanego na drożdżach, wiele mutacji funkcjonalnych ma niewielki lub żaden wpływ na te właściwości funkcjonalne (7 ) (Rysunek 1, A i B przedstawiają utratę powinowactwa ACE2, podczas gdy Rysunek S2 przedstawia spadek ekspresji RBD.
(A) Mapowanie przeciwciała w REGN-COV2.Wykres liniowy po lewej stronie pokazuje ucieczkę w każdym miejscu RBD (suma wszystkich mutacji w każdym miejscu).Obraz logo po prawej stronie pokazuje silną lokalizację ucieczki (fioletowe podkreślenie).Wysokość każdej litery jest proporcjonalna do siły ucieczki za pośrednictwem mutacji aminokwasu, a „wynik ucieczki” wynoszący 1 dla każdej mutacji odpowiada całkowitej ucieczce.Skala osi Y jest inna dla każdego wiersza, więc na przykład E406W unika wszystkich przeciwciał REGN, ale jest to najbardziej oczywiste w przypadku koktajli, ponieważ jest przytłoczony innymi miejscami ucieczki poszczególnych przeciwciał.W wersji skalowalnej S2, A i B służą do kolorowania mapy na podstawie wpływu mutacji na ekspresję złożonego RBD.S2, C i D służą do rozłożenia wpływu na powinowactwo ACE2 i ekspresję RBD wśród wszystkich mutacji obserwowanych w krążących izolatach wirusa.(B) Jak pokazano w (A), narysuj LY-CoV016.(C) Użyj pseudotypowanych cząstek lentiwirusa z kolcami, aby zweryfikować kluczowe mutacje w teście neutralizacji.Zdecydowaliśmy się zweryfikować mutacje, które, jak się przewiduje, będą miały większy wpływ lub występują z dużą częstotliwością w izolatach SARS-CoV-2 (takich jak N439K) w krążeniu.Każdy punkt reprezentuje krotność wzrostu średniego stężenia hamującego (IC50) mutacji w stosunku do piku niezmutowanego typu dzikiego (WT) zawierającego D614G.Niebieska linia przerywana 1 przedstawia efekt neutralizacji podobny do WT, a wartość> 1 oznacza zwiększoną odporność na neutralizację.Kolor kropki wskazuje, czy chcesz uciec z mapy.Kropki wskazują, że ponieważ IC50 znajduje się poza zastosowaną serią rozcieńczeń, sprawdzana jest wielokrotna zmiana (górna lub dolna granica).Większość mutantów testuje się w dwóch powtórzeniach, więc są dwa punkty.Pełną krzywą neutralizacji pokazano na rysunku 2. S3.Jednoliterowe skróty reszt aminokwasowych są następujące: A, Ala;C, cysteina;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, jego;Ja, Ile;K, lizyna;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, profesjonalista;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, tryptofan;i Y, Tyr.
Aby zweryfikować efekt antygenowy kluczowych mutacji, przeprowadziliśmy test neutralizacji przy użyciu pseudotypowanych cząstek lentiwirusa wiechy i stwierdziliśmy, że istnieje zgodność między mapą ucieczki wiązania przeciwciała a testem neutralizacji (ryc. 1C i ryc. S3).Zgodnie z oczekiwaniami na podstawie mapy przeciwciał REGN-COV2, mutacja w pozycji 486 jest neutralizowana jedynie przez REGN10933, podczas gdy mutacje w pozycjach 439 i 444 są neutralizowane jedynie przez REGN10987, więc mutacje te nie mogą uciec.Ale E406W uniknął dwóch przeciwciał REGN-COV2, więc również silnie uciekł z mieszaniny.Firma Regeneron uważa, że poprzez analizę strukturalną i selekcję wirusa ucieczki żadna pojedyncza mutacja aminokwasowa nie może uciec przed dwoma przeciwciałami w koktajlu (11, 12), ale nasza pełna mapa identyfikuje E406W jako mutację ucieczki koktajlu.E406W wpływa na przeciwciało REGN-COV2 w stosunkowo specyficzny sposób i nie zakłóca poważnie funkcji RBD, ponieważ tylko nieznacznie zmniejsza efekt neutralizacji LY-CoV016 (ryc. 1C) i miano wzbogaconych pseudotypowanych cząstek lentiwirusa (ryc. S3F).
Aby zbadać, czy nasza mapa ucieczki jest zgodna z ewolucją wirusów pod wpływem selekcji przeciwciał, najpierw sprawdziliśmy dane z eksperymentu selekcji ucieczki wirusa Regeneron, w którym skok ekspresji hodowano w hodowli komórkowej w obecności dowolnego REGN10933. wirus zapalenia jamy ustnej (VSV), REGN10987 lub koktajl REGN-COV2 (12).W pracy tej zidentyfikowano pięć mutacji ucieczki z REGN10933, dwie mutacje ucieczki z REGN10987 i brak mutacji z koktajlu (Rysunek 2A).Mutacje wybrane przez wszystkie siedem hodowli komórkowych są wyróżnione na naszej mapie ucieczki, dostępna jest również zmiana pojedynczego nukleotydu w kodonie typu dzikiego w sekwencji RBD Wuhan-Hu-1 (Rysunek 2B), co wskazuje na różnicę między ucieczkami. wykres i ewolucja wirusa pod ciśnieniem przeciwciał w hodowli komórkowej.Warto zauważyć, że do E406W nie można uzyskać dostępu poprzez zmiany pojedynczych nukleotydów, co może wyjaśniać, dlaczego selekcja koktajlu Regeneron nie może go zidentyfikować pomimo stosunkowo dobrej tolerancji zwijania RBD i powinowactwa ACE2.
(A) W obecności przeciwciał firma Regeneron wykorzystuje pseudotyp wiechowy VSV do selekcji mutacji uciekających wirusa w hodowli komórkowej (12).(B) Diagram ucieczki, jak pokazano na rycinie 1A, ale pokazuje tylko mutacje dostępne poprzez zmianę pojedynczego nukleotydu w sekwencji Wuhan-Hu-1.Kolor inny niż szary oznacza mutacje w hodowli komórkowej (czerwony) i zakażonych pacjentów (niebieski)) lub obie te mutacje (fioletowy).Rysunek S5 pokazuje te wykresy, które są pokolorowane w zależności od tego, jak mutacje wpływają na powinowactwo ACE2 lub ekspresję RBD.(C) Kinetyka mutacji RBD u pacjentów leczonych REGN-COV2 w 145. dniu zakażenia (pionowa linia czarna kropkowana).Częstotliwość powiązań między E484A i F486I wzrosła, ale ponieważ E484A nie jest mutacją ucieczki na naszym rysunku, nie pokazano tego na innych panelach.Zobacz także rysunek.S4.(D) Mutacje ucieczki, które występują w hodowli komórkowej i u zakażonych pacjentów, są dostępne za pomocą pojedynczego nukleotydu, a wiązanie przeciwciał ucieczki nie powoduje żadnego większego kosztu powinowactwa ACE2 [mierzonego metodą prezentacji drożdżowej (7)).Każdy punkt jest mutacją, a jego kształt i kolor wskazują, czy można uzyskać do niego dostęp i wybrać go podczas wzrostu wirusa.Im więcej punktów po prawej stronie na osi x wskazuje silniejszą ucieczkę wiązania przeciwciała;wyższe punkty na osi y wskazują wyższe powinowactwo ACE2.
Aby ustalić, czy Escape Atlas może analizować ewolucję wirusów zakażających ludzi, zbadaliśmy dane z głębokiego sekwencjonowania pochodzące od trwale zakażonego pacjenta z obniżoną odpornością, który otrzymał REGN-COV2 145. dnia po rozpoznaniu leczenia COVID-19 (16).Późne leczenie umożliwia populacji wirusa pacjenta akumulację różnorodności genetycznej, z których część może być spowodowana stresem immunologicznym, ponieważ przed leczeniem pacjent ma słabą odpowiedź przeciwciał autoneutralizujących (16).Po podaniu REGN-COV2 częstotliwość pięciu mutacji aminokwasów w RBD zmieniła się szybko (ryc. 2C i ryc. S4).Nasza mapa ucieczki pokazała, że trzy z tych mutacji uciekły z REGN10933, a jedna uciekła z REGN10987 (Rysunek 2B).Warto zauważyć, że po leczeniu przeciwciałem nie wszystkie mutacje zostały przeniesione do ustalonego miejsca.Wręcz przeciwnie, następuje wzrost i upadek konkurencji (rysunek 2C).Ten wzorzec zaobserwowano w wewnętrznej ewolucji adaptacyjnych żywicieli innych wirusów (17, 18), prawdopodobnie z powodu konkurencji między genetycznymi liniami wolnożyjącymi a liniami wirusowymi.Obie te siły wydają się odgrywać rolę u pacjentów z uporczywą infekcją (ryc. 2C i ryc. S4C): E484A (na naszym diagramie nie jest to mutacja ucieczki) i F486I (ucieczka REGN10933) przemieszczające się swobodnie po leczeniu oraz linie wirusa niosące N440D i Q493K (uciekający odpowiednio REGN10987 i REGN10933) najpierw konkurował z uciekającym mutantem REGN10933 Y489H, a następnie konkurował z linią noszącą E484A, F486I i Q493K.
Trzy z czterech mutacji ucieczki u pacjentów leczonych REGN-COV2 nie zostały zidentyfikowane podczas selekcji hodowli komórek wirusa Regeneron (Rysunek 2B), co ilustruje zaletę pełnej mapy.Selekcja wirusa jest niekompletna, ponieważ pozwala zidentyfikować jedynie mutacje wybrane losowo w konkretnym eksperymencie z hodowlą komórkową.Wręcz przeciwnie, pełna mapa opisuje wszystkie mutacje, do których mogą zaliczać się mutacje powstałe z przyczyn niezwiązanych z leczeniem, ale przypadkowo wpływające na wiązanie przeciwciał.
Oczywiście na ewolucję wirusów wpływają ograniczenia funkcjonalne i presja unikania przeciwciał.Mutacje i pacjenci wyselekcjonowani w hodowli komórkowej zawsze spełniają następujące kryteria: unikają wiązania przeciwciał, mogą przedostać się przez pojedynczą zmianę nukleotydu i mają niewielki lub żaden koszt powinowactwa ACE2 [poprzez poprzednie głębokie mutacje wykazane za pomocą pomiaru skaningowego drożdży RBD (7 )] (Rysunek 2D i Rysunek S5).Dlatego też do oceny możliwych ścieżek ewolucji wirusa można wykorzystać pełną mapę wpływu mutacji na kluczowe fenotypy biochemiczne RBD (takie jak ACE i wiązanie przeciwciał).Jedynym zastrzeżeniem jest to, że w dłuższych ramach czasowych ewolucji, jak zaobserwowano w przypadku odporności wirusowej i ucieczki leków, w wyniku interakcji epistatycznych, przestrzeń tolerancji dla mutacji może się zmienić (19-21).
Kompletna mapa pozwala nam ocenić istniejące mutacje ucieczki w krążącym SARS-CoV-2.Sprawdziliśmy wszystkie dostępne sekwencje SARS-CoV-2 pochodzenia ludzkiego na dzień 11 stycznia 2021 r. i odkryliśmy, że duża liczba mutacji RBD uniknęła jednego lub większej liczby przeciwciał (ryc. 3).Jednakże jedyną mutacją ucieczki obecną w >0,1% sekwencji jest mutant ucieczki REGN10933 Y453F [0,3% sekwencji;patrz (12)], mutant ucieczki REGN10987 N439K [1,7% sekwencji;patrz Figura 1C i (22)], oraz mutacja ucieczki LY-CoV016 K417N (sekwencja 0,1%; patrz także Figura 1C).Y453F jest powiązany z niezależnymi ogniskami związanymi z fermami norek w Holandii i Danii (23, 24);warto zauważyć, że sama sekwencja norek zawiera czasami inne mutacje ucieczki, takie jak F486L (24).N439K jest bardzo popularny w Europie i stanowi dużą część sekwencji pochodzącej ze Szkocji i Irlandii w Europie (22, 25).K417N występuje w linii B.1.351 odkrytej po raz pierwszy w Republice Południowej Afryki (10).Inną mutacją budzącą obecnie obawy jest N501Y, która występuje w B.1.351, a także w linii B.1.1.7 pierwotnie zidentyfikowanej w Wielkiej Brytanii (9).Nasza mapa pokazuje, że N501Y nie ma wpływu na przeciwciało REGN-COV2, a jedynie umiarkowany wpływ na LY-CoV016 (ryc. 3).
Dla każdego przeciwciała lub kombinacji przeciwciał, według stanu na 11 stycznia 2021 r., spośród 317 866 wysokiej jakości sekwencji SARS-CoV-2 pochodzenia ludzkiego w GISAID (26), zależność między wynikiem ucieczki dla każdej mutacji a jej częstotliwością.Jest zaznaczone.Mutacja ucieczki koktajlu REGN-COV2 E406W wymaga wielu zmian nukleotydowych w sekwencji RBD Wuhan-Hu-1 i nie jest obserwowana w sekwencji GISAID.Inne mutacje reszty E406 (E406Q i E406D) zaobserwowano przy zliczaniu z niską częstotliwością, ale te zmutowane aminokwasy nie są mutacjami pojedynczego nukleotydu daleko od W.
Zgodnie z oczekiwaniami mutacje ucieczki zwykle występują na styku przeciwciało-RBD.Jednak sama struktura nie wystarczy, aby przewidzieć, które mutacje pośredniczą w ucieczce.Na przykład LY-CoV016 wykorzystuje swoje łańcuchy ciężkie i lekkie do wiązania się z szerokim epitopem, który zachodzi na powierzchnię wiążącą ACE2, ale proces ucieczki obejmuje mutacje w resztach RBD w regionie determinującym komplementarność łańcucha ciężkiego (Rysunek 4A i Rysunek S6, od E do G).Natomiast ucieczki z REGN10933 i REGN10987 występowały głównie w resztach RBD ułożonych na styku łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała (Figura 4A i Figura S6, A do D).Mutacja E406W, która uciekła z mieszaniny REGN-COV2, wystąpiła w resztach, które nie miały kontaktu z żadnym przeciwciałem (Rysunek 4, A i B).Chociaż E406 jest strukturalnie bliższy LY-CoV016 (ryc. 4B i ryc. S6H), mutacja E406W ma znacznie mniejszy wpływ na przeciwciało (ryc. 1, B i C), co wskazuje, że specyficzny mechanizm strukturalny dalekiego zasięgu jest anty-REGN - Przeciwciało COV2 (Rysunek S6I).Podsumowując, mutacje w resztach RBD mających kontakt z przeciwciałami nie zawsze pośredniczą w ucieczce, a pewne znaczące mutacje ucieczki występują w resztach nie mających kontaktu z przeciwciałami (Figura 4B i Figura S6, D i G).
(A) Diagram ucieczki rzutowany na strukturę RBD związaną przez przeciwciało.[REGN10933 i REGN10987: Baza danych białek (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: ID PDB 7C01 (13)].Domeny zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała pokazano w postaci niebieskich kreskówek, a kolor na powierzchni RBD wskazuje siłę ucieczki za pośrednictwem mutacji w tym miejscu (biały oznacza brak ucieczki, a czerwony oznacza najsilniejszy miejsce ucieczki przeciwciała lub mieszaniny).Witryny, które nie zostały zmutowane funkcjonalnie, są wyszarzone.(B) Dla każdego przeciwciała sklasyfikować miejsce jako bezpośredni kontakt z przeciwciałem (atomy inne niż wodór w odległości 4Å od przeciwciała), przeciwciało bliższe (4 do 8Å) lub przeciwciało dystalne (> 8Å).Każdy punkt reprezentuje miejsce podzielone na miejsce ucieczki (czerwony) i brak ucieczki (czarny).Szara linia przerywana przedstawia wartość krytyczną stosowaną do klasyfikacji miejsca jako ewakuacyjnego lub nieuciekającego (więcej informacji można znaleźć w sekcji Materiały i metody).Czerwone i czarne liczby wskazują, ile witryn w każdej kategorii zostało objętych lub nie ma ucieczki.
W tym badaniu całkowicie zmapowaliśmy mutacje, które omijają trzy główne przeciwciała anty-SARS-CoV-2.Mapy te wskazują, że poprzednia charakterystyka mutacji ucieczki jest niekompletna.Nie zidentyfikowano ani mutacji pojedynczych aminokwasów, które mogą ominąć dwa przeciwciała w koktajlu REGN-COV2, ani nie zidentyfikowano większości pacjentów z przetrwałymi infekcjami leczonych koktajlem.mutacja.Oczywiście nasza mapa nie odpowiedziała jeszcze na najpilniejsze pytanie: czy SARS-CoV-2 rozwinie rozległą odporność na te przeciwciała?Pewne jest jednak to, że niepokojące jest to, że tak wiele mutacji ucieczki ma niewielki wpływ na zwijanie RBD lub powinowactwo receptora, a w krążących wirusach występują już pewne mutacje niskiego poziomu.Ostatecznie trzeba poczekać i obserwować, jakie mutacje przekaże SARS-CoV-2, gdy rozprzestrzeni się wśród populacji.Nasza praca pomoże w „obserwacji” poprzez natychmiastowe wyjaśnienie wpływu mutacji sklasyfikowanych na podstawie nadzoru genomu wirusa.
To jest artykuł o otwartym dostępie, rozpowszechniany na warunkach licencji Creative Commons Uznanie autorstwa.Artykuł pozwala na nieograniczone wykorzystanie, dystrybucję i reprodukcję na dowolnym nośniku pod warunkiem prawidłowego cytowania oryginalnego dzieła.
Uwaga: Prosimy Cię jedynie o podanie adresu e-mail, aby osoba, którą polecisz stronie, wiedziała, że chcesz, aby zobaczyła wiadomość i że nie jest to spam.Nie będziemy przechwytywać żadnych adresów e-mail.
To pytanie służy do sprawdzenia, czy jesteś gościem i zapobiegania automatycznemu przesyłaniu spamu.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Pełna mapa mutacji SARS-CoV-2, które wymykają się mieszaninie przeciwciał monoklonalnych Regeneron, pomaga wyjaśnić ewolucję wirusa w leczeniu pacjentów.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Pełna mapa mutacji SARS-CoV-2, które wymykają się mieszaninie przeciwciał monoklonalnych Regeneron, pomaga wyjaśnić ewolucję wirusa w leczeniu pacjentów.
©2021 Amerykańskie Stowarzyszenie Rozwoju Nauki.Wszelkie prawa zastrzeżone.AAAS jest partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Czas publikacji: 24 lutego 2021 r