Vários anticorpos já estão em uso ou em desenvolvimento como terapias para o tratamento da COVID-19.Com o surgimento de novas variantes do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2), é importante prever se ainda serão suscetíveis à terapia com anticorpos.Starr et al.Foi utilizada uma biblioteca de leveduras, que abrange todas as mutações no domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2 que não irá perturbar fortemente a ligação ao receptor hospedeiro (ACE2), e mapeia como essas mutações afetam os três principais anti-SARS-CoV -2 ligação de anticorpos.Estes números identificam mutações que escapam à ligação dos anticorpos, incluindo mutações únicas que escapam aos dois anticorpos na mistura de anticorpos Regeneron.Muitas mutações que escapam a um único anticorpo estão se espalhando em humanos.
Os anticorpos são uma terapia potencial para o tratamento do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2), mas não está claro se o vírus se desenvolve para escapar ao risco.Aqui, mapeamos como todas as mutações no domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2 (RBD) afetam a ligação do coquetel REGN-COV2 ao anticorpo LY-CoV016.Esses mapas completos revelaram uma mutação de aminoácidos que evitou completamente a mistura REGN-COV2, que é composta por dois anticorpos REGN10933 e REGN10987 que têm como alvo diferentes epítopos estruturais.Estes números também identificam mutações virais selecionadas em pacientes persistentemente infectados tratados com REGN-COV2 e durante a seleção de fuga do vírus in vitro.Finalmente, estes números revelam que as mutações que escapam a um único anticorpo já estão presentes nas estirpes circulantes do SARS-CoV-2.Estes mapas de fuga completos podem explicar as consequências das mutações observadas durante a vigilância do vírus.
Anticorpos estão sendo desenvolvidos para tratar o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) (1).Os anticorpos contra alguns outros vírus podem tornar-se ineficazes por mutações virais selecionadas durante o tratamento de pacientes infectados (2, 3) ou por mutações virais que se espalharam globalmente para conferir resistência a todo o clado do vírus.Portanto, determinar quais mutações do SARS-CoV-2 podem escapar dos principais anticorpos é fundamental para avaliar como as mutações observadas durante a vigilância do vírus afetam a eficácia da terapia com anticorpos.
A maioria dos principais anticorpos anti-SARS-CoV-2 tem como alvo o domínio de ligação ao receptor viral (RBD), que medeia a ligação ao receptor da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) (5, 6).Recentemente, desenvolvemos um método de varredura profunda de mutações para mapear como todas as mutações do RBD afetam sua função e reconhecimento por anticorpos antivirais (7, 8).O método envolve a criação de uma biblioteca de mutantes RBD, expressando-os na superfície da levedura e usando classificação celular ativada por fluorescência e sequenciamento profundo para quantificar como cada mutação afeta o dobramento de RBD, a afinidade ACE2 (medida em uma série de titulação) e a ligação de anticorpos. (Figura S1A).Neste estudo, utilizamos a biblioteca de mutantes repetitivos descrita em (7), que é composta por variantes RBD com código de barras, cobrindo 3.804 das 3.819 possíveis mutações de aminoácidos.Nossa biblioteca foi preparada a partir da base genética RBD do isolado inicial Wuhan-Hu-1.Embora a frequência de vários mutantes esteja aumentando, eles ainda representam as sequências RBD mais comuns (9, 10).Desenhamos duas de 2.034 mutações que não interrompem fortemente o dobramento do RBD e a ligação da ECA (7), como passar o coquetel REGN-COV2 (REGN10933 e REGN10987) (11, 12) e o LY-CoV016 da Eli Lilly. O anticorpo afeta o método de ligação do anticorpo (também chamado CB6 ou JS016) (13) (Figura S1B).O REGN-COV2 recebeu recentemente uma autorização de uso emergencial para COVID-19 (14), enquanto o LY-CoV016 está atualmente passando por ensaios clínicos de fase 3 (15).
[Glu406→Trp(E406W)] escapou fortemente da mistura de dois anticorpos (Figura 1A).O mapa de escape do LY-CoV016 também revelou muitas mutações de escape em diferentes locais do RBD (Figura 1B).Embora algumas mutações de escape possam prejudicar a capacidade do RBD de se ligar à ACE2 ou de se expressar numa forma adequadamente dobrada, de acordo com medições anteriores de varrimento profundo de mutações utilizando RBD exibido em leveduras, muitas mutações funcionais têm pouco ou nenhum efeito sobre estas propriedades funcionais (7 ) (Figura 1, A e B representam a perda de afinidade de ACE2, enquanto a Figura S2 representa a diminuição na expressão de RBD.
(A) Mapeamento do anticorpo em REGN-COV2.O gráfico de linhas à esquerda mostra o escape em cada local do RBD (a soma de todas as mutações em cada local).A imagem do logotipo à direita mostra o forte local de fuga (sublinhado roxo).A altura de cada letra é proporcional à força do escape mediado pela mutação do aminoácido, e uma “pontuação de escape” de 1 para cada mutação corresponde a um escape completo.A escala do eixo y é diferente para cada linha, então, por exemplo, E406W escapa de todos os anticorpos REGN, mas é mais óbvio para coquetéis porque é sobrecarregado por outros locais de escape de anticorpos individuais.Para a versão escalável, S2, A e B são usados para colorir o mapa de como as mutações afetam a expressão do RBD dobrado.S2, C e D são usados para distribuir a influência na afinidade de ACE2 e na expressão de RBD entre todas as mutações observadas em isolados de vírus circulantes.(B) Conforme mostrado em (A), desenhe LY-CoV016.(C) Use partículas lentivirais pseudotipadas para verificar as principais mutações no ensaio de neutralização.Optamos por verificar as mutações que se prevê terem maior impacto ou existirem com alta frequência em isolados de SARS-CoV-2 (como N439K) na circulação.Cada ponto representa o aumento da concentração inibitória mediana (IC50) da mutação em relação ao pico do tipo selvagem não mutado (WT) contendo D614G.A linha tracejada azul 1 representa um efeito de neutralização semelhante ao WT, e um valor> 1 representa um aumento da resistência de neutralização.A cor do ponto indica se você deseja escapar do mapa.Os pontos indicam que como o IC50 está fora da série de diluições utilizada, a alteração múltipla é verificada (limite superior ou inferior).A maioria dos mutantes é testada em duplicata, portanto há dois pontos.A curva de neutralização completa é mostrada na Figura 2. S3.As abreviaturas de uma letra dos resíduos de aminoácidos são as seguintes: A, Ala;C, Cisteína;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, dele;Eu, Ile;K, lisina;L, Liu;Metrópole N, Assen;P, Pró;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptofano;e Y, Tyr.
Para verificar o efeito antigênico das mutações-chave, realizamos um ensaio de neutralização utilizando partículas lentivirais pseudotipadas de panícula e descobrimos que havia uma consistência entre o mapa de escape de ligação de anticorpos e o ensaio de neutralização (Figura 1C e Figura S3).Como esperado do mapa de anticorpos REGN-COV2, a mutação na posição 486 só é neutralizada pelo REGN10933, enquanto a mutação nas posições 439 e 444 é apenas neutralizada pelo REGN10987, pelo que estas mutações não podem escapar.Mas o E406W escapou dos dois anticorpos REGN-COV2, por isso também escapou fortemente da mistura.Através da análise estrutural e da seleção de escape do vírus, a Regeneron acredita que nenhuma mutação de aminoácido pode escapar dos dois anticorpos no coquetel (11, 12), mas nosso mapa completo identifica E406W como uma mutação de escape do coquetel.E406W afeta o anticorpo REGN-COV2 de uma forma relativamente específica e não interfere seriamente na função do RBD, porque reduz apenas ligeiramente o efeito de neutralização do LY-CoV016 (Figura 1C) e o título de partículas lentivirais pseudotipadas fortificadas (Figura S3F).
A fim de explorar se o nosso mapa de escape é consistente com a evolução dos vírus sob seleção de anticorpos, primeiro verificamos os dados do experimento de seleção de escape do vírus Regeneron, no qual o pico de expressão foi cultivado em cultura de células na presença de qualquer REGN10933. vírus da estomatite (VSV), REGN10987 ou coquetel REGN-COV2 (12).Este trabalho identificou cinco mutações de escape do REGN10933, duas mutações de escape do REGN10987 e nenhuma mutação do coquetel (Figura 2A).As mutações selecionadas por todas as sete culturas celulares são destacadas em nosso mapa de escape, e a alteração de nucleotídeo único do códon de tipo selvagem na sequência RBD de Wuhan-Hu-1 também é acessível (Figura 2B), indicando a diferença entre os escapes Concordância gráfico e evolução do vírus sob pressão de anticorpos em cultura celular.É importante notar que o E406W não pode ser acessado por alterações de nucleotídeo único, o que pode explicar por que a seleção do coquetel Regeneron não consegue identificá-lo, apesar da tolerância relativamente boa ao dobramento de RBD e à afinidade de ACE2.
(A) Na presença de anticorpos, a Regeneron utiliza o pseudotipo VSV da panícula para selecionar mutações de escape do vírus em cultura celular (12).(B) O diagrama de escape, conforme mostrado na Figura 1A, mas mostra apenas as mutações acessíveis por uma única alteração de nucleotídeo na sequência Wuhan-Hu-1.Não cinza indica mutações em cultura de células (vermelho) e pacientes infectados (azul), ou ambos (roxo).A Figura S5 mostra esses gráficos, que são coloridos de acordo com a forma como as mutações afetam a afinidade do ACE2 ou a expressão do RBD.(C) Cinética da mutação RBD em pacientes tratados com REGN-COV2 no 145º dia de infecção (linha vertical pontilhada preta).A frequência de ligação entre E484A e F486I aumentou, mas como E484A não é uma mutação de escape na nossa figura, não é mostrada em outros painéis.Veja também a figura.S4.(D) As mutações de escape que ocorrem na cultura celular e nos pacientes infectados são acessíveis por um único nucleotídeo, e a ligação dos anticorpos de escape não causa nenhum custo importante para a afinidade da ACE2 [conforme medido pelo método de exibição em levedura (7)].Cada ponto é uma mutação, e sua forma e cor indicam se ele pode ser acessado e selecionado durante o crescimento do vírus.Os pontos mais à direita no eixo x indicam um escape de ligação de anticorpo mais forte;os pontos mais altos no eixo y indicam maior afinidade ACE2.
Para determinar se o Escape Atlas pode analisar a evolução dos vírus que infectam humanos, examinamos dados de sequenciamento profundo de um paciente imunocomprometido persistentemente infectado que recebeu REGN-COV2 no 145º dia após o diagnóstico do tratamento para COVID-19 (16).O tratamento tardio permite que a população viral do paciente acumule diversidade genética, parte da qual pode ser causada por estresse imunológico, porque o paciente apresenta uma fraca resposta de anticorpos autoneutralizantes antes do tratamento (16).Após a administração de REGN-COV2, a frequência de cinco mutações de aminoácidos no RBD mudou rapidamente (Figura 2C e Figura S4).Nosso mapa de escape mostrou que três dessas mutações escaparam do REGN10933 e uma escapou do REGN10987 (Figura 2B).Vale ressaltar que após o tratamento com anticorpos, nem todas as mutações foram transferidas para o sítio fixo.Pelo contrário, há o aumento e a queda da concorrência (Figura 2C).Este padrão foi observado na evolução interna dos hospedeiros adaptativos de outros vírus (17, 18), possivelmente devido à competição entre linhagens genéticas livres e virais.Ambas as forças parecem desempenhar um papel em pacientes com infecção persistente (Figura 2C e Figura S4C): E484A (não uma mutação de escape em nosso diagrama) e F486I (escape REGN10933) em liberdade após o tratamento, e linhagens de vírus carregando N440D E Q493K (escapando de REGN10987 e REGN10933, respectivamente) competiu primeiro com o mutante de escape REGN10933 Y489H e depois competiu com a linhagem carregando E484A e F486I e Q493K.
Três das quatro mutações de escape em pacientes tratados com REGN-COV2 não foram identificadas na seleção de cultura de células virais da Regeneron (Figura 2B), o que ilustra a vantagem do mapa completo.A seleção do vírus é incompleta porque eles só podem identificar quaisquer mutações selecionadas aleatoriamente naquele experimento específico de cultura de células.Pelo contrário, o mapa completo anota todas as mutações, que podem incluir mutações causadas por razões não relacionadas com o tratamento, mas que afectam acidentalmente a ligação dos anticorpos.
É claro que a evolução dos vírus é afetada por limitações funcionais e pela pressão para escapar dos anticorpos.As mutações e os pacientes selecionados na cultura celular sempre atendem aos seguintes critérios: eles escapam da ligação do anticorpo, podem entrar através de uma única alteração de nucleotídeo e têm pouco ou nenhum custo para a afinidade da ACE2 [através das mutações profundas anteriores exibidas usando medição de varredura de levedura RBD (7 )] (Figura 2D e Figura S5).Portanto, um mapa completo de como as mutações afetam os principais fenótipos bioquímicos do RBD (como ECA e ligação de anticorpos) pode ser usado para avaliar possíveis caminhos para a evolução do vírus.Uma ressalva é que num período evolutivo mais longo, como observado na imunidade viral e na fuga de drogas, devido a interações epistáticas, o espaço de tolerância para mutações pode mudar (19-21).
O mapa completo permite-nos avaliar as mutações de escape existentes no SARS-CoV-2 circulante.Verificamos todas as sequências de SARS-CoV-2 de origem humana disponíveis em 11 de janeiro de 2021 e descobrimos que um grande número de mutações RBD escapou de um ou mais anticorpos (Figura 3).No entanto, a única mutação de escape presente em> 0,1% da sequência é o mutante de escape REGN10933 Y453F [0,3% da sequência;ver (12)], mutante de escape REGN10987 N439K [1,7% da sequência;veja a Figura 1C e (22)], e a mutação de escape K417N do LY-CoV016 (sequência de 0,1%; veja também a Figura 1C).O Y453F está associado a surtos independentes relacionados com explorações de visons nos Países Baixos e na Dinamarca (23, 24);vale a pena notar que a própria sequência do vison às vezes contém outras mutações de escape, como F486L (24).O N439K é muito popular na Europa e constitui uma grande parte da sequência da Escócia e da Irlanda na Europa (22, 25).K417N existe na linhagem B.1.351 descoberta pela primeira vez na África do Sul (10).Outra mutação que preocupa atualmente é a N501Y, que está presente em B.1.351 e também na linhagem B.1.1.7 originalmente identificada no Reino Unido (9).Nosso mapa mostra que o N501Y não tem efeito sobre o anticorpo REGN-COV2, mas apenas efeito moderado sobre o LY-CoV016 (Figura 3).
Para cada anticorpo ou combinação de anticorpos, em 11 de janeiro de 2021, entre as 317.866 sequências de SARS-CoV-2 derivadas de humanos de alta qualidade no GISAID (26), a relação entre a pontuação de escape para cada mutação e sua frequência.Está marcado.A mutação de escape do coquetel REGN-COV2 E406W requer múltiplas alterações de nucleotídeos na sequência RBD de Wuhan-Hu-1 e não é observada na sequência GISAID.Outras mutações do resíduo E406 (E406Q e E406D) foram observadas com contagem de baixa frequência, mas esses aminoácidos mutantes não são mutações de nucleotídeo único distantes de W.
Como esperado, as mutações de escape geralmente ocorrem na interface anticorpo-RBD.No entanto, a estrutura por si só não é suficiente para prever quais mutações medeiam a fuga.Por exemplo, LY-CoV016 usa suas cadeias pesada e leve para se ligar a um epítopo amplo que se sobrepõe à superfície de ligação de ACE2, mas o processo de escape envolve mutações em resíduos RBD na região determinante de complementaridade da cadeia pesada (Figura 4A e Figura S6, E a G).Em contraste, os escapes de REGN10933 e REGN10987 ocorreram principalmente nos resíduos RBD empilhados na interface das cadeias pesada e leve do anticorpo (Figura 4A e Figura S6, A a D).A mutação E406W que escapou da mistura REGN-COV2 ocorreu em resíduos que não estavam em contato com nenhum dos anticorpos (Figura 4, A e B).Embora E406 esteja estruturalmente mais próximo de LY-CoV016 (Figura 4B e Figura S6H), a mutação E406W tem um efeito muito menor no anticorpo (Figura 1, B e C), indicando que o mecanismo estrutural específico de longo alcance é anti-REGN - Anticorpo COV2 (Figura S6I).Em resumo, mutações em resíduos RBD em contato com anticorpos nem sempre medeiam o escape, e algumas mutações de escape significativas ocorrem em resíduos que não estão em contato com anticorpos (Figura 4B e Figura S6, D e G).
(A) O diagrama de escape projetado na estrutura RBD ligada pelo anticorpo.[REGN10933 e REGN10987: Banco de Dados de Proteínas (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo são mostrados como desenhos azuis, e a cor na superfície do RBD indica a força do escape mediado por mutação neste local (o branco indica que não há escape e o vermelho indica o escape mais forte). local de escape do anticorpo ou mistura).Os sites que não apresentam mutação funcional ficam esmaecidos.(B) Para cada anticorpo, classifique o local como contato direto com anticorpo (átomos que não sejam de hidrogênio dentro de 4Å do anticorpo), anticorpo proximal (4 a 8Å) ou anticorpo distal (> 8Å).Cada ponto representa um local, dividido em escape (vermelho) ou não escape (preto).A linha tracejada cinza representa o valor crítico usado para classificar o local como fuga ou não fuga (para detalhes, ver Materiais e Métodos).Os números vermelhos e pretos indicam quantos sites em cada categoria escaparam ou não.
Neste estudo, mapeamos completamente as mutações que escapam aos três principais anticorpos anti-SARS-CoV-2.Estes mapas indicam que a caracterização anterior das mutações de escape está incompleta.Não foram identificadas mutações únicas de aminoácidos que possam escapar dos dois anticorpos no coquetel REGN-COV2, nem identificaram a maioria dos pacientes com infecção persistente tratados com o coquetel.mutação.É claro que o nosso mapa ainda não respondeu à questão mais premente: Irá o SARS-CoV-2 desenvolver extensa resistência a estes anticorpos?Mas o que é certo é que é preocupante que tantas mutações de escape tenham pouco efeito no dobramento do RBD ou na afinidade do receptor, e já existam algumas mutações de baixo nível nos vírus circulantes.No final das contas, é preciso esperar e observar quais mutações o SARS-CoV-2 transmitirá quando se espalhar pela população.Nosso trabalho ajudará na “observação”, explicando imediatamente o impacto das mutações classificadas pela vigilância do genoma viral.
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O mapa completo das mutações do SARS-CoV-2 que escapam à mistura de anticorpos monoclonais Regeneron ajuda a explicar a evolução do vírus no tratamento de pacientes.
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Horário da postagem: 24 de fevereiro de 2021