Mai mulți anticorpi sunt deja utilizați sau în curs de dezvoltare ca terapii pentru tratamentul COVID-19.Odată cu apariția noilor variante ale sindromului respirator acut sever coronavirus 2 (SARS-CoV-2), este important să se prezică dacă acestea vor fi în continuare susceptibile la terapia cu anticorpi.Starr și colab.A fost utilizată o bibliotecă de drojdie, care acoperă toate mutațiile din domeniul de legare a receptorului SARS-CoV-2 care nu vor perturba puternic legarea de receptorul gazdă (ACE2) și va mapa modul în care aceste mutații afectează cele trei Principalele anti-SARS-CoV. -2 legarea anticorpilor.Aceste cifre identifică mutații care scapă de legarea anticorpilor, inclusiv mutații unice care scapă de cei doi anticorpi din amestecul de anticorpi Regeneron.Multe mutații care scapă de un singur anticorp se răspândesc la oameni.
Anticorpii sunt o terapie potențială pentru tratamentul sindromului respirator acut sever coronavirus 2 (SARS-CoV-2), dar nu este clar că virusul se dezvoltă pentru a scăpa de riscul lor.Aici, mapăm modul în care toate mutațiile din domeniul de legare a receptorului SARS-CoV-2 (RBD) afectează legarea cocktail-ului REGN-COV2 la anticorpul LY-CoV016.Aceste hărți complete au dezvăluit o mutație a aminoacizilor care a evitat complet amestecul REGN-COV2, care este compus din doi anticorpi REGN10933 și REGN10987 care vizează epitopi structurali diferiți.Aceste cifre identifică, de asemenea, mutațiile virale selectate la pacienții infectați persistent tratați cu REGN-COV2 și în timpul selecției de evadare a virusului in vitro.În cele din urmă, aceste cifre arată că mutațiile care scapă de un singur anticorp sunt deja prezente în tulpinile SARS-CoV-2 circulante.Aceste hărți complete de evadare pot explica consecințele mutațiilor observate în timpul supravegherii virusului.
Se dezvoltă anticorpi pentru a trata sindromul respirator acut sever coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (1).Anticorpii împotriva anumitor alte virusuri pot deveni ineficienți prin mutații virale selectate în timpul tratamentului pacienților infectați (2, 3) sau mutații virale care s-au răspândit la nivel global pentru a conferi rezistență întregii clade virale.Prin urmare, determinarea care mutații SARS-CoV-2 pot scăpa de anticorpi cheie este esențială pentru a evalua modul în care mutațiile observate în timpul supravegherii virusului afectează eficacitatea terapiei cu anticorpi.
Majoritatea anticorpilor anti-SARS-CoV-2 vizează domeniul de legare a receptorului viral (RBD), care mediază legarea la receptorul enzimei de conversie a angiotensinei 2 (ACE2) (5, 6).Recent, am dezvoltat o metodă de scanare a mutațiilor profunde pentru a mapa modul în care toate mutațiile RBD îi afectează funcția și recunoașterea de către anticorpii antivirali (7, 8).Metoda implică crearea unei biblioteci de mutanți RBD, exprimându-le pe suprafața drojdiei și utilizarea sortării celulelor activate prin fluorescență și secvențierea profundă pentru a cuantifica modul în care fiecare mutație afectează plierea RBD, afinitatea ACE2 (măsurată într-o serie de titrare) și legarea anticorpilor. (Figura S1A).În acest studiu, am folosit biblioteca mutantă repetitivă descrisă în (7), care este compusă din variante RBD cu coduri de bare, acoperind 3804 dintre cele 3819 posibile mutații de aminoacizi.Biblioteca noastră a fost pregătită din fundalul genetic RBD al izolatului timpuriu Wuhan-Hu-1.Deși frecvența mai multor mutanți este în creștere, ei reprezintă încă cele mai comune secvențe RBD (9, 10).Am desenat două dintre cele 2034 de mutații care nu perturbă puternic plierea RBD și legarea ACE (7) cum se trece cocktail-ul REGN-COV2 (REGN10933 și REGN10987) (11, 12) și LY-CoV016 a lui Eli Lilly Forma recombinantă a anticorpul afectează metoda de legare a anticorpului (numit și CB6 sau JS016) (13) (Figura S1B).REGN-COV2 a primit recent o autorizație de utilizare de urgență pentru COVID-19 (14), în timp ce LY-CoV016 este în prezent în faza 3 de studii clinice (15).
[Glu406→Trp(E406W)] a scăpat puternic din amestecul de doi anticorpi (Figura 1A).Harta de evacuare a LY-CoV016 a dezvăluit, de asemenea, multe mutații de evadare la diferite locuri din RBD (Figura 1B).Deși unele mutații de evadare pot afecta capacitatea RBD de a se lega de ACE2 sau de a se exprima într-o formă pliată corespunzător, conform măsurătorilor anterioare ale scanării mutațiilor profunde folosind RBD afișat cu drojdie, multe mutații funcționale au un efect redus sau deloc asupra acestor proprietăți funcționale (7). ) (Figura 1, A și B reprezintă pierderea afinității ACE2, în timp ce Figura S2 reprezintă scăderea expresiei RBD.
(A) Cartografierea anticorpului în REGN-COV2.Graficul cu linii din stânga arată evadarea la fiecare loc din RBD (suma tuturor mutațiilor de la fiecare loc).Imaginea siglei din dreapta arată locația puternică de evadare (subliniere violetă).Înălțimea fiecărei litere este proporțională cu puterea evadării mediată de mutația aminoacizilor, iar un „scor de evadare” de 1 pentru fiecare mutație corespunde unei evadari complete.Scara axei y este diferită pentru fiecare rând, așa că, de exemplu, E406W scapă de toți anticorpii REGN, dar este cel mai evident pentru cocktailuri, deoarece este copleșit de celelalte locuri de evacuare ale anticorpilor individuali.Pentru versiunea scalabilă, S2, A și B sunt folosite pentru a colora harta în funcție de modul în care mutațiile afectează expresia RBD pliat.S2, C și D sunt folosite pentru a distribui influența asupra afinității ACE2 și a expresiei RBD între toate mutațiile observate în izolatele de virus circulant.(B) După cum se arată în (A), desenați LY-CoV016.(C) Utilizați particule lentivirale pseudotipate cu vârf pentru a verifica mutațiile cheie în testul de neutralizare.Am ales să verificăm mutațiile despre care se preconizează că vor avea un impact mai mare sau care există la o frecvență ridicată în izolatele SARS-CoV-2 (cum ar fi N439K) în circulație.Fiecare punct reprezintă creșterea de ori a concentrației mediane inhibitoare (IC50) a mutației în raport cu vârful de tip sălbatic nemutat (WT) care conține D614G.Linia întreruptă albastră 1 reprezintă un efect de neutralizare similar cu WT, iar o valoare > 1 reprezintă o rezistență crescută la neutralizare.Culoarea punctului indică dacă doriți să evadați de pe hartă.Punctele indică faptul că, deoarece IC50 este în afara seriei de diluții utilizate, modificarea multiplă este verificată (limită superioară sau inferioară).Majoritatea mutanților sunt testați în duplicat, așa că există două puncte.Curba de neutralizare completă este prezentată în Figura 2. S3.Abrevierile cu o literă ale resturilor de aminoacizi sunt după cum urmează: A, Ala;C, cisteină;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, al lui;eu, Ile;K, lizină;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptofan;și Y, Tyr.
Pentru a verifica efectul antigenic al mutațiilor cheie, am efectuat un test de neutralizare folosind particule lentivirale pseudotipizate în paniculă și am constatat că există o consistență între harta de evadare a legăturii anticorpilor și testul de neutralizare (Figura 1C și Figura S3).După cum era de așteptat din harta anticorpilor REGN-COV2, mutația de la poziția 486 este neutralizată doar de REGN10933, în timp ce mutația de la pozițiile 439 și 444 este neutralizată doar de REGN10987, astfel încât aceste mutații nu pot scăpa.Dar E406W a scăpat de cei doi anticorpi REGN-COV2, așa că a scăpat și puternic din amestec.Prin analiza structurală și selecția de evadare a virusului, Regeneron consideră că nicio mutație de aminoacizi nu poate scăpa de cei doi anticorpi din cocktail (11, 12), dar harta noastră completă identifică E406W ca o mutație de evadare de cocktail.E406W afectează anticorpul REGN-COV2 într-un mod relativ specific și nu interferează în mod serios cu funcția RBD, deoarece reduce doar puțin efectul de neutralizare al LY-CoV016 (Figura 1C) și titrul particulelor lentivirale pseudotipizate cu vârfuri (Figura 1C). S3F).
Pentru a explora dacă harta noastră de evadare este în concordanță cu evoluția virusurilor sub selecția anticorpilor, am verificat mai întâi datele experimentului de selecție de evadare a virusului Regeneron, în care vârful de expresie a fost crescut în cultură celulară în prezența oricărui REGN10933 Vezicular. virusul stomatitei (VSV), REGN10987 sau cocktail REGN-COV2 (12).Această lucrare a identificat cinci mutații de evadare de la REGN10933, două mutații de evadare de la REGN10987 și nicio mutație de la cocktail (Figura 2A).Mutațiile selectate de toate cele șapte culturi celulare sunt evidențiate în harta noastră de evadare, iar schimbarea cu un singur nucleotidă a codonului de tip sălbatic din secvența RBD Wuhan-Hu-1 este, de asemenea, accesibilă (Figura 2B), indicând diferența dintre evadări Concordanță graficul și evoluția virusului sub presiunea anticorpilor în cultura celulară.Este de remarcat faptul că E406W nu poate fi accesat prin modificări de nucleotidă unică, ceea ce poate explica de ce selecția de cocktail Regeneron nu îl poate identifica în ciuda toleranței relativ bune la plierea RBD și afinitatea ACE2.
(A) În prezența anticorpilor, Regeneron utilizează pseudotipul de paniculă VSV pentru a selecta mutațiile de evadare ale virusului în cultura celulară (12).(B) Diagrama de evadare, așa cum se arată în Figura 1A, dar arată doar mutațiile accesibile printr-o singură schimbare de nucleotidă în secvența Wuhan-Hu-1.Non-gri indică mutații în cultura celulară (roșu) și pacienții infectați (albastru) sau ambele (violet).Figura S5 prezintă aceste grafice, care sunt colorate în funcție de modul în care mutațiile afectează afinitatea ACE2 sau expresia RBD.(C) Cinetica mutației RBD la pacienții tratați cu REGN-COV2 în a 145-a zi de infecție (linie verticală punctată neagră).Frecvența legăturii dintre E484A și F486I a crescut, dar deoarece E484A nu este o mutație de evadare în figura noastră, nu este afișată în alte panouri.Vezi și figura.S4.(D) Mutațiile de evadare care apar în cultura celulară și pacienții infectați sunt accesibile printr-o singură nucleotidă, iar legarea anticorpilor de evadare nu provoacă niciun cost major pentru afinitatea ACE2 [măsurată prin metoda de afișare a drojdiei (7)].Fiecare punct este o mutație, iar forma și culoarea acestuia indică dacă poate fi accesat și selectat în timpul creșterii virusului.Cele mai multe puncte din dreapta pe axa x indică o evadare mai puternică a legăturii anticorpilor;punctele mai înalte de pe axa y indică o afinitate mai mare pentru ACE2.
Pentru a determina dacă Escape Atlas poate analiza evoluția virușilor care infectează oamenii, am examinat datele de secvențiere profundă de la un pacient imunocompromis persistent infectat care a primit REGN-COV2 în a 145-a zi după diagnosticul de Tratament COVID-19 (16).Tratamentul tardiv permite populației virale a pacientului să acumuleze diversitate genetică, dintre care unele pot fi determinate de stresul imunitar, deoarece pacientul are un răspuns slab cu anticorpi autoneutralizanți înainte de tratament (16).După administrarea REGN-COV2, frecvența a cinci mutații de aminoacizi în RBD s-a schimbat rapid (Figura 2C și Figura S4).Harta noastră de evadare a arătat că trei dintre aceste mutații au scăpat de REGN10933 și una a scăpat de REGN10987 (Figura 2B).Este de remarcat faptul că, după tratamentul cu anticorpi, nu toate mutațiile au fost transferate la locul fix.Dimpotrivă, există creșterea și scăderea concurenței (Figura 2C).Acest tipar a fost observat în evoluția internă a gazdelor adaptive ale altor virusuri (17, 18), posibil din cauza competiției dintre descendența genetică și liniile virale.Ambele aceste forțe par să joace un rol la pacienții cu infecție persistentă (Figura 2C și Figura S4C): E484A (nu este o mutație de evadare în diagrama noastră) și F486I (escape REGN10933) care se deplasează liber după tratament și liniile de virus care poartă N440D și Q493K (scăpat de REGN10987 și, respectiv, REGN10933) a concurat mai întâi cu mutantul de evadare REGN10933 Y489H și apoi a concurat cu descendența care poartă E484A și F486I și Q493K.
Trei dintre cele patru mutații de evadare la pacienții tratați cu REGN-COV2 nu au fost identificate în selecția culturii de celule virale Regeneron (Figura 2B), ceea ce ilustrează avantajul hărții complete.Selecția virusului este incompletă, deoarece aceștia pot identifica doar orice mutații selectate aleatoriu în acel experiment de cultură celulară.Dimpotrivă, harta completă adnotă toate mutațiile, care pot include mutații cauzate din motive care nu au legătură cu tratamentul, dar afectează accidental legarea anticorpilor.
Desigur, evoluția virusurilor este afectată de limitări funcționale și de presiunea de a evita anticorpii.Mutațiile și pacienții selectați în cultura celulară îndeplinesc întotdeauna următoarele criterii: ei scapă de legarea anticorpilor, pot intra printr-o singură modificare a nucleotidei și au costuri reduse sau deloc pentru afinitatea ACE2 [prin mutațiile profunde anterioare afișate folosind măsurarea scanării cu drojdie RBD (7) )] (Figura 2D și Figura S5).Prin urmare, o hartă completă a modului în care mutațiile afectează fenotipurile biochimice cheie ale RBD (cum ar fi ACE și legarea anticorpilor) poate fi utilizată pentru a evalua căile posibile pentru evoluția virusului.Un avertisment este că într-un interval de timp evolutiv mai lung, așa cum s-a observat în imunitatea virală și evadarea medicamentelor, din cauza interacțiunilor epistatice, spațiul de toleranță pentru mutații se poate modifica (19-21).
Harta completă ne permite să evaluăm mutațiile de evadare existente în SARS-CoV-2 circulant.Am verificat toate secvențele SARS-CoV-2 derivate de la om disponibile începând cu 11 ianuarie 2021 și am constatat că un număr mare de mutații RBD au scăpat de unul sau mai mulți anticorpi (Figura 3).Cu toate acestea, singura mutație de evadare prezentă în >0,1% din secvență este mutantul de evadare REGN10933 Y453F [0,3% din secvență;vezi (12)], REGN10987 mutant de evadare N439K [1,7% din secvenţă;vezi Figura 1C și (22)] și LY-CoV016 scapă mutația K417N (secvență 0,1%; vezi și Figura 1C).Y453F este asociat cu focare independente legate de fermele de nurci din Țările de Jos și Danemarca (23, 24);este de remarcat faptul că secvența de nurcă în sine conține uneori și alte mutații de evadare, cum ar fi F486L (24).N439K este foarte popular în Europa și constituie o mare parte a secvenței din Scoția și Irlanda în Europa (22, 25).K417N există în descendența B.1.351 descoperită pentru prima dată în Africa de Sud (10).O altă mutație de interes actual este N501Y, care este prezentă în B.1.351 și, de asemenea, în descendența B.1.1.7 identificată inițial în Marea Britanie (9).Harta noastră arată că N501Y nu are niciun efect asupra anticorpului REGN-COV2, ci doar un efect moderat asupra LY-CoV016 (Figura 3).
Pentru fiecare anticorp sau combinație de anticorpi, începând cu 11 ianuarie 2021, dintre cele 317.866 de secvențe SARS-CoV-2 de înaltă calitate derivate de la om de pe GISAID (26), relația dintre scorul de evadare pentru fiecare mutație și frecvența acesteia .Este marcat.Mutația de evacuare a cocktailului REGN-COV2 E406W necesită modificări multiple de nucleotide în secvența Wuhan-Hu-1 RBD și nu este observată în secvența GISAID.Alte mutații ale reziduului E406 (E406Q și E406D) au fost observate cu numărare cu frecvență joasă, dar acești aminoacizi mutanți nu sunt mutații cu un singur nucleotide departe de W.
După cum era de așteptat, mutațiile de evadare apar de obicei în interfața anticorp-RBD.Cu toate acestea, structura singură nu este suficientă pentru a prezice care mutații mediază evadarea.De exemplu, LY-CoV016 își folosește lanțurile grele și ușoare pentru a se lega la un epitop larg care se suprapune pe suprafața de legare a ACE2, dar procesul de evadare implică mutații în reziduurile RBD în regiunea care determină complementaritatea lanțului greu (Figura 4A și Figura S6, E la G).În schimb, evadările de la REGN10933 și REGN10987 au avut loc în principal la reziduurile RBD stivuite la interfața lanțurilor grele și ușoare de anticorpi (Figura 4A și Figura S6, de la A la D).Mutația E406W care a scăpat de amestecul REGN-COV2 a apărut la reziduuri care nu au fost în contact cu niciun anticorp (Figura 4, A și B).Deși E406 este structural mai aproape de LY-CoV016 (Figura 4B și Figura S6H), mutația E406W are un efect mult mai mic asupra anticorpului (Figura 1, B și C), indicând faptul că mecanismul structural specific pe rază lungă este anti-REGN. - anticorp COV2 (Figura S6I).În rezumat, mutațiile la resturile RBD în contact cu anticorpii nu mediază întotdeauna evacuarea și unele mutații semnificative de evacuare apar la reziduurile care nu sunt în contact cu anticorpii (Figura 4B și Figura S6, D și G).
(A) Diagrama de evacuare proiectată pe structura RBD legată de anticorp.[REGN10933 şi REGN10987: Baza de date de proteine (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: ID PDB 7C01 (13)].Domeniile variabile ale lanțurilor grele și ușoare ale anticorpului sunt prezentate ca desene animate albastre, iar culoarea de pe suprafața RBD indică puterea scăpării mediate de mutație la acest loc (albul indică nicio scăpare, iar roșul indică cea mai puternică evadare). locul de evacuare al anticorpului sau al amestecului).Site-urile care nu sunt modificate funcțional sunt incolore.(B) Pentru fiecare anticorp, clasificați site-ul ca contact direct cu anticorpul (atomi non-hidrogen în 4 Å de anticorp), anticorp proximal (4 până la 8Å) sau anticorp distal (> 8Å).Fiecare punct reprezintă un loc, împărțit în evadare (roșu) sau non-evadare (negru).Linia gri întreruptă reprezintă valoarea critică utilizată pentru a clasifica site-ul ca evadare sau non-evacuare (pentru detalii, consultați Materiale și metode).Numerele roșii și negre indică câte site-uri din fiecare categorie sunt evadate sau neescape.
În acest studiu, am cartografiat complet mutațiile care evadează cei trei anticorpi majori anti-SARS-CoV-2.Aceste hărți indică faptul că caracterizarea anterioară a mutațiilor de evadare este incompletă.Nici mutațiile unice de aminoacizi care pot scăpa de cei doi anticorpi din cocktailul REGN-COV2 nu au fost identificate și nici nu au identificat majoritatea pacienților cu infecție persistentă tratați cu cocktail.mutaţie.Desigur, harta noastră nu a răspuns încă la cea mai presantă întrebare: SARS-CoV-2 va dezvolta o rezistență extinsă la acești anticorpi?Dar ceea ce este cert este că este îngrijorător faptul că atât de multe mutații de evadare au un efect redus asupra plierii RBD sau asupra afinității receptorului și există deja câteva mutații de nivel scăzut în virusurile circulante.În final, este necesar să așteptăm și să observăm ce mutații va transmite SARS-CoV-2 atunci când se va răspândi în rândul populației.Munca noastră va ajuta la „observare” explicând imediat impactul mutațiilor clasificate prin supravegherea genomului viral.
Acesta este un articol cu acces deschis distribuit în conformitate cu termenii licenței de atribuire Creative Commons.Articolul permite utilizarea, distribuirea și reproducerea fără restricții pe orice mediu, cu condiția ca opera originală să fie citată în mod corespunzător.
Notă: Vă cerem doar să furnizați adresa dvs. de e-mail, astfel încât persoana pe care o recomandați paginii să știe că doriți ca ea să vadă e-mailul și că nu este spam.Nu vom captura nicio adresă de e-mail.
Această întrebare este folosită pentru a testa dacă sunteți un vizitator și pentru a preveni trimiterea automată de spam.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Harta completă a mutațiilor SARS-CoV-2 care scapă din amestecul de anticorpi monoclonali Regeneron ajută la explicarea evoluției virusului în tratarea pacienților.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Harta completă a mutațiilor SARS-CoV-2 care scapă din amestecul de anticorpi monoclonali Regeneron ajută la explicarea evoluției virusului în tratarea pacienților.
©2021 Asociația Americană pentru Avansarea Științei.toate drepturile rezervate.AAAS este partener al HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef și COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Ora postării: 24-feb-2021