Некоторые антитела уже используются или разрабатываются в качестве методов лечения COVID-19.С появлением новых вариантов коронавируса 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2) важно прогнозировать, будут ли они по-прежнему восприимчивы к терапии антителами.Старр и др.Была использована дрожжевая библиотека, которая охватывает все мутации в связывающем домене рецептора SARS-CoV-2, которые не сильно нарушают связывание с рецептором хозяина (ACE2), и отображает, как эти мутации влияют на три основных анти-SARS-CoV. -2 связывание антител.На этих рисунках указаны мутации, которые ускользают от связывания антител, включая одиночные мутации, которые ускользают от двух антител в смеси антител Regeneron.Многие мутации, выходящие за пределы одного антитела, распространяются среди людей.
Антитела являются потенциальной терапией для лечения тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), однако неясно, развивается ли вирус, чтобы избежать риска.Здесь мы отображаем, как все мутации в домене, связывающем рецептор SARS-CoV-2 (RBD), влияют на связывание коктейля REGN-COV2 с антителом LY-CoV016.Эти полные карты выявили аминокислотную мутацию, которая полностью ускользнула от смеси REGN-COV2, состоящей из двух антител REGN10933 и REGN10987, нацеленных на разные структурные эпитопы.Эти цифры также идентифицируют мутации вируса, выбранные у пациентов с персистирующей инфекцией, получавших REGN-COV2, и во время отбора вируса, ускользающего от вируса in vitro.Наконец, эти цифры показывают, что мутации, выходящие за пределы одного антитела, уже присутствуют в циркулирующих штаммах SARS-CoV-2.Эти полные карты побега могут объяснить последствия мутаций, наблюдаемых во время эпиднадзора за вирусом.
Разрабатываются антитела для лечения тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом 2 (SARS-CoV-2) (1).Антитела против некоторых других вирусов могут стать неэффективными из-за мутаций вируса, выбранных во время лечения инфицированных пациентов (2, 3), или вирусных мутаций, которые распространились по всему миру и придали устойчивость всей кладе вируса.Поэтому определение того, какие мутации SARS-CoV-2 могут ускользнуть от ключевых антител, имеет решающее значение для оценки того, как мутации, наблюдаемые во время эпиднадзора за вирусом, влияют на эффективность терапии антителами.
Большинство ведущих антител против SARS-CoV-2 нацелены на домен связывания вирусного рецептора (RBD), который опосредует связывание с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2) (5, 6).Недавно мы разработали метод глубокого сканирования мутаций, чтобы определить, как все мутации RBD влияют на его функцию и распознавание противовирусными антителами (7, 8).Метод включает создание библиотеки мутантов RBD, их экспрессию на поверхности дрожжей, а также использование сортировки клеток, активируемой флуоресценцией, и глубокого секвенирования для количественной оценки того, как каждая мутация влияет на сворачивание RBD, аффинность ACE2 (измеряется в серии титрования) и связывание антител. (Рисунок S1A).В этом исследовании мы использовали библиотеку повторяющихся мутантов, описанную в (7), которая состоит из закодированных вариантов RBD, охватывающих 3804 из 3819 возможных аминокислотных мутаций.Наша библиотека была подготовлена на основе генетического фона RBD раннего изолята Wuhan-Hu-1.Хотя частота некоторых мутантов увеличивается, они по-прежнему представляют собой наиболее распространенные последовательности RBD (9, 10).Мы выявили две из 2034 мутаций, которые не сильно нарушают сворачивание RBD и связывание ACE (7), как передать коктейль REGN-COV2 (REGN10933 и REGN10987) (11, 12) и LY-CoV016 компании Eli Lilly. антитело влияет на метод связывания антитела (также называемого CB6 или JS016) (13) (рис. S1B).REGN-COV2 недавно получил разрешение на экстренное использование при COVID-19 (14), а LY-CoV016 в настоящее время проходит третью фазу клинических испытаний (15).
[Glu406→Trp(E406W)] практически не подвергался воздействию смеси двух антител (рис. 1А).Карта ускользания LY-CoV016 также выявила множество мутаций ускользания в разных сайтах RBD (рис. 1B).Хотя некоторые ускользающие мутации могут ухудшать способность RBD связываться с ACE2 или экспрессироваться в соответствующей свернутой форме, согласно предыдущим измерениям сканирования глубоких мутаций с использованием RBD, отображаемого на дрожжах, многие функциональные мутации практически не влияют на эти функциональные свойства (7 ) (Рис. 1, A и B представляют потерю аффинности ACE2, а рисунок S2 представляет снижение экспрессии RBD.
(A) Картирование антитела в REGN-COV2.Линейный график слева показывает побег на каждом сайте RBD (сумма всех мутаций на каждом сайте).Изображение логотипа справа показывает сильное место эвакуации (фиолетовое подчеркивание).Высота каждой буквы пропорциональна силе ускользания, опосредованного мутацией аминокислоты, а «оценка ускользания», равная 1 для каждой мутации, соответствует полному ускользанию.Шкала оси Y различна для каждой строки, поэтому, например, E406W ускользает от всех антител REGN, но это наиболее очевидно для коктейлей, поскольку он подавляется другими сайтами ускользания отдельных антител.В масштабируемой версии S2, A и B используются для раскрашивания карты того, как мутации влияют на экспрессию свернутого RBD.S2, C и D используются для распределения влияния на аффинность ACE2 и экспрессию RBD среди всех мутаций, наблюдаемых в циркулирующих изолятах вируса.(B) Как показано на (A), нарисуйте LY-CoV016.(C) Используйте лентивирусные частицы, псевдотипированные шипами, для проверки ключевых мутаций в анализе нейтрализации.Мы решили проверить мутации, которые, по прогнозам, будут иметь большее влияние или существовать с высокой частотой в изолятах SARS-CoV-2 (таких как N439K), находящихся в кровообращении.Каждая точка представляет собой кратное увеличение средней ингибирующей концентрации (IC50) мутации относительно пика немутированного дикого типа (WT), содержащего D614G.Синяя пунктирная линия 1 представляет эффект нейтрализации, аналогичный эффекту WT, а значение > 1 представляет собой повышенную устойчивость к нейтрализации.Цвет точки указывает, хотите ли вы сбежать с карты.Точки указывают на то, что, поскольку IC50 находится за пределами используемой серии разведений, проверяется многократное изменение (верхний или нижний предел).Большинство мутантов тестируются в двух экземплярах, поэтому есть два момента.Полная кривая нейтрализации показана на рисунке 2. S3.Однобуквенные сокращения аминокислотных остатков следующие: A, Ala;С, цистеин;Д, Асп;Е, Глу;Ф, Фе;Г, Гли;Х, его;Я, Иль;К, лизин;Л, Лю;Метрополис Н, Ассен;П, Про;Q, Глн;Р, Арг;С, Сер;Т, Тре;В, Вал;W, триптофан;и Ю, Тир.
Чтобы проверить антигенный эффект ключевых мутаций, мы провели анализ нейтрализации с использованием метельчатых псевдотипированных лентивирусных частиц и обнаружили соответствие между картой уклонения от связывания антител и анализом нейтрализации (рис. 1C и рис. S3).Как и ожидалось на карте антител REGN-COV2, мутация в положении 486 нейтрализуется только REGN10933, тогда как мутация в положениях 439 и 444 нейтрализуется только REGN10987, поэтому эти мутации не могут ускользнуть.Но E406W избежал воздействия двух антител REGN-COV2, поэтому он также сильно избежал смеси.Благодаря структурному анализу и отбору ускользающих вирусов компания Regeneron считает, что ни одна аминокислотная мутация не может избежать двух антител в коктейле (11, 12), но наша полная карта идентифицирует E406W как ускользающую мутацию коктейля.E406W влияет на антитело REGN-COV2 относительно специфическим образом и не оказывает серьезного влияния на функцию RBD, поскольку лишь незначительно снижает нейтрализующий эффект LY-CoV016 (рис. 1C) и титр псевдотипированных лентивирусных частиц с шипами (рис. С3Ф).
Чтобы выяснить, согласуется ли наша карта побега с эволюцией вирусов при селекции антител, мы сначала проверили данные эксперимента по селекции побега вируса Regeneron, в котором пик экспрессии выращивался в клеточной культуре в присутствии любого REGN10933. вирус стоматита (VSV), REGN10987 или коктейль REGN-COV2 (12).Эта работа выявила пять escape-мутаций из REGN10933, две escape-мутации из REGN10987 и отсутствие мутаций из коктейля (рис. 2A).Мутации, выбранные всеми семью клеточными культурами, выделены на нашей карте побегов, а также доступно однонуклеотидное изменение кодона дикого типа в последовательности RBD Wuhan-Hu-1 (рис. 2B), что указывает на разницу между побегами. график и эволюция вируса под давлением антител в клеточной культуре.Стоит отметить, что к E406W невозможно получить доступ путем изменения одиночных нуклеотидов, что может объяснить, почему коктейль Regeneron не может идентифицировать его, несмотря на относительно хорошую толерантность к сворачиванию RBD и сродству к ACE2.
(A) В присутствии антител Regeneron использует псевдотип VSV метелки для отбора мутаций, ускользающих от вируса, в культуре клеток (12).(B) Диаграмма побега, как показано на рисунке 1A, но показывает только мутации, доступные при изменении одного нуклеотида в последовательности Wuhan-Hu-1.Несерый цвет указывает на мутации в клеточной культуре (красный) и у инфицированных пациентов (синий) или в обоих случаях (фиолетовый).На рисунке S5 показаны эти графики, которые окрашены в зависимости от того, как мутации влияют на аффинность ACE2 или экспрессию RBD.(C) Кинетика мутации RBD у пациентов, получавших REGN-COV2, на 145-й день инфекции (черная пунктирная вертикальная линия).Частота сцепления между E484A и F486I увеличилась, но поскольку E484A не является ускользающей мутацией на нашем рисунке, она не показана на других панелях.См. также рисунок.С4.(D) Ускользающие мутации, которые происходят в клеточной культуре и у инфицированных пациентов, доступны с помощью одного нуклеотида, и связывание ускользающих антител не приводит к каким-либо серьезным затратам для сродства ACE2 [согласно измерению методом дрожжевого дисплея (7)].Каждая точка представляет собой мутацию, а ее форма и цвет указывают, можно ли к ней получить доступ и выбрать ее во время роста вируса.Большее количество правых точек на оси X указывает на более сильное ускользание связывания антитела;более высокие точки на оси y указывают на более высокое сродство к ACE2.
Чтобы определить, может ли Escape Atlas анализировать эволюцию вирусов, заражающих людей, мы изучили данные глубокого секвенирования у постоянно инфицированного пациента с ослабленным иммунитетом, который получил REGN-COV2 на 145-й день после постановки диагноза лечения COVID-19 (16).Позднее лечение позволяет вирусной популяции пациента накапливать генетическое разнообразие, часть которого может быть вызвана иммунным стрессом, поскольку до лечения у пациента наблюдается слабый аутонейтрализующий ответ антител (16).После введения REGN-COV2 частота мутаций пяти аминокислот в RBD быстро изменилась (рис. 2C и рис. S4).Наша карта побега показала, что три из этих мутаций ускользнули от REGN10933 и одна ускользнула от REGN10987 (рис. 2B).Стоит отметить, что после лечения антителами не все мутации были перенесены в фиксированный сайт.Напротив, наблюдается рост и падение конкуренции (рис. 2C).Эта закономерность наблюдалась во внутренней эволюции адаптивных хозяев других вирусов (17, 18), возможно, из-за конкуренции между генетическими и вирусными линиями.Обе эти силы, по-видимому, играют роль у пациентов с персистирующей инфекцией (рис. 2C и рис. S4C): E484A (не ускользающая мутация на нашей диаграмме) и F486I (ускользающая REGN10933) свободно перемещаются после лечения, а также вирусные линии, несущие N440D и Q493K (ускользающий от REGN10987 и REGN10933 соответственно) сначала конкурировал с ускользающим мутантом REGN10933 Y489H, а затем конкурировал с линией, несущей E484A, F486I и Q493K.
Три из четырех ускользающих мутаций у пациентов, получавших REGN-COV2, не были идентифицированы при выборе культуры вирусных клеток Regeneron (рис. 2B), что иллюстрирует преимущество полной карты.Выбор вируса является неполным, поскольку они могут идентифицировать только любые мутации, случайно выбранные в этом конкретном эксперименте с культурой клеток.Напротив, полная карта аннотирует все мутации, которые могут включать мутации, вызванные причинами, не связанными с лечением, но случайно влияющими на связывание антител.
Конечно, на эволюцию вирусов влияют функциональные ограничения и необходимость уклоняться от антител.Мутации и пациенты, выбранные в клеточной культуре, всегда соответствуют следующим критериям: они избегают связывания антител, могут проникнуть через однонуклеотидное изменение и практически не требуют затрат на аффинность ACE2 [благодаря предыдущим глубоким мутациям, отображаемым с помощью измерения дрожжевого сканирования RBD (7 )] (рис. 2D и рис. S5).Таким образом, полная карта того, как мутации влияют на ключевые биохимические фенотипы RBD (такие как связывание АПФ и антител), может быть использована для оценки возможных путей эволюции вируса.Одно предостережение заключается в том, что в более длительных эволюционных временных рамках, как это наблюдается в случае вирусного иммунитета и бегства лекарств, из-за эпистатических взаимодействий пространство толерантности к мутациям может измениться (19-21).
Полная карта позволяет нам оценить существующие ускользающие мутации у циркулирующего SARS-CoV-2.Мы проверили все доступные последовательности SARS-CoV-2 человеческого происхождения по состоянию на 11 января 2021 г. и обнаружили, что большое количество мутаций RBD ускользнуло от одного или нескольких антител (рис. 3).Однако единственной ускользающей мутацией, присутствующей в >0,1% последовательности, является ускользающий мутант REGN10933 Y453F [0,3% последовательности;см. (12)], эскейп-мутант REGN10987 N439K [1,7% последовательности;см. рисунок 1C и (22)], а также ускользающую мутацию LY-CoV016 K417N (0,1% последовательности; см. также рисунок 1C).Y453F связан с независимыми вспышками, связанными с норковыми фермами в Нидерландах и Дании (23, 24);стоит отметить, что сама последовательность норки иногда содержит другие escape-мутации, такие как F486L (24).N439K очень популярен в Европе и составляет большую часть последовательности из Шотландии и Ирландии в Европе (22, 25).K417N существует в линии B.1.351, впервые обнаруженной в Южной Африке (10).Другая мутация, вызывающая беспокойство в настоящее время, — это N501Y, которая присутствует в B.1.351, а также в линии B.1.1.7, первоначально идентифицированной в Великобритании (9).Наша карта показывает, что N501Y не влияет на антитела REGN-COV2, а лишь умеренно влияет на LY-CoV016 (рис. 3).
Для каждого антитела или комбинации антител по состоянию на 11 января 2021 г. среди 317 866 высококачественных последовательностей SARS-CoV-2 человеческого происхождения в GISAID (26) соотношение между показателем ускользания для каждой мутации и ее частотой.Это отмечено.Ускользающая мутация E406W коктейля REGN-COV2 требует множественных нуклеотидных изменений в последовательности RBD Wuhan-Hu-1 и не наблюдается в последовательности GISAID.Другие мутации остатка E406 (E406Q и E406D) наблюдались при низкочастотном подсчете, но эти мутантные аминокислоты не являются однонуклеотидными мутациями, далекими от W.
Как и ожидалось, ускользающие мутации обычно происходят на границе раздела антитело-RBD.Однако одной только структуры недостаточно, чтобы предсказать, какие мутации способствуют бегству.Например, LY-CoV016 использует свои тяжелые и легкие цепи для связывания с широким эпитопом, который перекрывает поверхность связывания ACE2, но процесс ускользания включает мутации в остатках RBD в области, определяющей комплементарность тяжелой цепи (рис. 4A и рис. S6, E–1). Г).Напротив, ускользания от REGN10933 и REGN10987 в основном происходили в остатках RBD, уложенных на границе раздела тяжелых и легких цепей антитела (рис. 4A и рис. S6, от A до D).Мутация E406W, ускользнувшая от смеси REGN-COV2, произошла в остатках, которые не контактировали ни с одним антителом (рис. 4, A и B).Хотя E406 структурно ближе к LY-CoV016 (рис. 4B и рис. S6H), мутация E406W оказывает гораздо меньшее влияние на антитело (рис. 1, B и C), что указывает на то, что специфическим структурным механизмом дальнего действия является анти-REGN. - Антитело COV2 (рис. S6I).Таким образом, мутации в остатках RBD, контактирующих с антителами, не всегда опосредуют ускользание, а некоторые значительные мутации ускользания происходят в остатках, не контактирующих с антителами (рис. 4B и рис. S6, D и G).
(A) Диаграмма выхода, проецируемая на структуру RBD, связанную антителом.[REGN10933 и REGN10987: База данных белков (PDB) с идентификатором 6XDG (11);LY-CoV016: идентификатор PDB 7C01 (13)].Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела показаны синими рисунками, а цвет на поверхности RBD указывает на силу ускользания, опосредованного мутацией, в этом сайте (белый цвет указывает на отсутствие ускользания, а красный указывает на самый сильный место выхода антитела или смеси).Сайты, которые функционально не изменены, выделены серым цветом.(B) Для каждого антитела классифицируйте сайт как прямой контакт с антителом (неводородные атомы в пределах 4 Å антитела), проксимальное антитело (от 4 до 8 Å) или дистальное антитело (> 8 Å).Каждая точка представляет собой участок, разделенный на участки, с которых можно сбежать (красный) или не сбежать (черный).Серая пунктирная линия представляет критическое значение, используемое для классификации участка как «побег» или «непобег» (подробнее см. «Материалы и методы»).Красные и черные цифры указывают, сколько сайтов в каждой категории экранированы или не экранированы.
В этом исследовании мы полностью картировали мутации, которые уклоняются от трех основных антител против SARS-CoV-2.Эти карты показывают, что предыдущая характеристика мутаций побега является неполной.Не было выявлено ни одной аминокислотной мутации, которая могла бы избежать действия двух антител в коктейле REGN-COV2, и они не выявили большинство пациентов с персистирующей инфекцией, получавших этот коктейль.мутация.Конечно, наша карта еще не ответила на самый актуальный вопрос: разовьется ли у SARS-CoV-2 обширная устойчивость к этим антителам?Но что можно сказать наверняка, так это то, что вызывает беспокойство тот факт, что такое большое количество ускользающих мутаций мало влияет на сворачивание RBD или сродство к рецепторам, а в циркулирующих вирусах уже существуют некоторые мутации низкого уровня.В конце концов, необходимо подождать и понаблюдать, какие мутации передаст SARS-CoV-2 при распространении среди населения.Наша работа поможет «наблюдению», сразу объясняя влияние мутаций, классифицированных с помощью наблюдения за вирусным геномом.
Это статья в открытом доступе, распространяемая на условиях лицензии Creative Commons Attribution License.Статья разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего цитирования оригинальной работы.
Примечание. Мы просим вас указать свой адрес электронной почты только для того, чтобы человек, которого вы рекомендуете на странице, знал, что вы хотите, чтобы он увидел это электронное письмо и что это не спам.Мы не будем захватывать адреса электронной почты.
Этот вопрос используется, чтобы проверить, являетесь ли вы посетителем, и предотвратить автоматическую рассылку спама.
Тайлер Н.Старр, Эллисон Дж.Грини, Амин Аддетия, Уильям В. Хэннон, Маниш С. Чоудхари (Manish C. Choudhary), Адам С. Дингес (Adam S.
Полная карта мутаций SARS-CoV-2, которые ускользают от смеси моноклональных антител Regeneron, помогает объяснить эволюцию вируса при лечении пациентов.
Тайлер Н.Старр, Эллисон Дж.Грини, Амин Аддетия, Уильям В. Хэннон, Маниш С. Чоудхари (Manish C. Choudhary), Адам С. Дингес (Adam S.
Полная карта мутаций SARS-CoV-2, которые ускользают от смеси моноклональных антител Regeneron, помогает объяснить эволюцию вируса при лечении пациентов.
©2021 Американская ассоциация содействия развитию науки.все права защищены.AAAS является партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Время публикации: 24 февраля 2021 г.