Niekoľko protilátok sa už používa alebo je vo vývoji ako terapie na liečbu COVID-19.So vznikom nových variantov koronavírusu 2 závažného akútneho respiračného syndrómu (SARS-CoV-2) je dôležité predpovedať, či budú stále citlivé na liečbu protilátkami.Starr a kol.Použila sa knižnica kvasiniek, ktorá pokrýva všetky mutácie vo väzbovej doméne SARS-CoV-2 receptora, ktoré nebudú silne narúšať väzbu na hostiteľský receptor (ACE2), a mapuje, ako tieto mutácie ovplyvňujú tri hlavné anti-SARS-CoV -2 viazanie protilátky.Tieto obrázky identifikujú mutácie, ktoré unikajú väzbe protilátky, vrátane jednotlivých mutácií, ktoré unikajú dvom protilátkam v zmesi protilátok Regeneron.U ľudí sa šíri veľa mutácií, ktoré uniknú jedinej protilátke.
Protilátky sú potenciálnou terapiou na liečbu koronavírusu 2 ťažkého akútneho respiračného syndrómu (SARS-CoV-2), ale nie je jasné, či sa vírus vyvíja, aby unikol ich riziku.Tu mapujeme, ako všetky mutácie vo väzbovej doméne SARS-CoV-2 receptora (RBD) ovplyvňujú väzbu REGN-COV2 koktailu na protilátku LY-CoV016.Tieto kompletné mapy odhalili aminokyselinovú mutáciu, ktorá sa úplne vyhla zmesi REGN-COV2, ktorá sa skladá z dvoch protilátok REGN10933 a REGN10987, ktoré sa zameriavajú na rôzne štrukturálne epitopy.Tieto obrázky tiež identifikujú vírusové mutácie vybrané u trvalo infikovaných pacientov liečených REGN-COV2 a počas in vitro selekcie úniku vírusu.Nakoniec tieto obrázky odhaľujú, že mutácie, ktoré unikli jedinej protilátke, sú už prítomné v cirkulujúcich kmeňoch SARS-CoV-2.Tieto úplné únikové mapy môžu vysvetliť dôsledky mutácií pozorovaných počas sledovania vírusov.
Vyvíjajú sa protilátky na liečbu závažného akútneho respiračného syndrómu koronavírusu 2 (SARS-CoV-2) (1).Protilátky proti niektorým iným vírusom môžu byť neúčinné vírusovými mutáciami vybranými počas liečby infikovaných pacientov (2, 3) alebo vírusovými mutáciami, ktoré sa rozšírili globálne, aby poskytli rezistenciu celému vírusovému kladu.Určenie, ktoré mutácie SARS-CoV-2 môžu uniknúť kľúčovým protilátkam, je preto rozhodujúce pre posúdenie toho, ako mutácie pozorované počas sledovania vírusov ovplyvňujú účinnosť protilátkovej terapie.
Väčšina popredných anti-SARS-CoV-2 protilátok sa zameriava na vírusovú receptorovú väzbovú doménu (RBD), ktorá sprostredkúva väzbu na receptor angiotenzín konvertujúceho enzýmu 2 (ACE2) (5, 6).Nedávno sme vyvinuli metódu skenovania hlbokých mutácií, aby sme zmapovali, ako všetky mutácie RBD ovplyvňujú jeho funkciu a rozpoznávanie antivírusovými protilátkami (7, 8).Metóda zahŕňa vytvorenie knižnice mutantov RBD, ich expresiu na povrchu kvasiniek a použitie fluorescenčne aktivovaného triedenia buniek a hlbokého sekvenovania na kvantifikáciu toho, ako každá mutácia ovplyvňuje skladanie RBD, afinitu ACE2 (meranú v titračnej sérii) a väzbu protilátky. (Obrázok S1A).V tejto štúdii sme použili knižnicu repetitívnych mutantov opísanú v (7), ktorá sa skladá z variantov RBD s čiarovým kódom, pokrývajúcich 3804 z 3819 možných mutácií aminokyselín.Naša knižnica bola pripravená z genetického pozadia RBD skorého izolátu Wuhan-Hu-1.Hoci sa frekvencia niekoľkých mutantov zvyšuje, stále predstavujú najbežnejšie sekvencie RBD (9, 10).Nakreslili sme dve z 2034 mutácií, ktoré silne nenarušujú skladanie RBD a väzbu ACE (7), ako odovzdať kokteil REGN-COV2 (REGN10933 a REGN10987) (11, 12) a LY-CoV016 Eli Lilly Rekombinantná forma Protilátka ovplyvňuje spôsob viazania protilátky (tiež nazývaná CB6 alebo JS016) (13) (obrázok S1B).REGN-COV2 nedávno získalo povolenie na núdzové použitie pre COVID-19 (14), zatiaľ čo LY-CoV016 v súčasnosti prechádza 3. fázou klinických skúšok (15).
[Glu406→Trp(E406W)] silne unikol zmesi dvoch protilátok (obrázok 1A).Úniková mapa LY-CoV016 tiež odhalila veľa únikových mutácií na rôznych miestach v RBD (obrázok 1B).Aj keď niektoré únikové mutácie môžu narušiť schopnosť RBD viazať sa na ACE2 alebo exprimovať vo vhodne zloženej forme, podľa predchádzajúcich meraní skenovania hlbokých mutácií pomocou RBD s kvasinkami, mnohé funkčné mutácie majú malý alebo žiadny vplyv na tieto funkčné vlastnosti (7 ) (Obrázok 1, A a B predstavujú stratu afinity ACE2, zatiaľ čo obrázok S2 predstavuje zníženie expresie RBD.
(A) Mapovanie protilátky v REGN-COV2.Čiarový graf vľavo ukazuje únik na každom mieste v RBD (súčet všetkých mutácií na každom mieste).Obrázok loga vpravo zobrazuje silné miesto úniku (fialové podčiarknutie).Výška každého písmena je úmerná sile úniku sprostredkovaného mutáciou aminokyseliny a „únikové skóre“ 1 pre každú mutáciu zodpovedá úplnému úniku.Mierka osi y je pre každý riadok iná, takže napríklad E406W unikne všetkým REGN protilátkam, no najzreteľnejšie je to pri koktejloch, pretože je zahltené inými únikovými miestami jednotlivých protilátok.Pre škálovateľnú verziu sa S2, A a B používajú na zafarbenie mapy podľa toho, ako mutácie ovplyvňujú expresiu zloženého RBD.S2, C a D sa používajú na rozdelenie vplyvu na afinitu ACE2 a expresiu RBD medzi všetky mutácie pozorované v izolátoch cirkulujúceho vírusu.(B) Ako je znázornené na (A), nakreslite LY-CoV016.(C) Použite hrot-pseudotypové lentivírusové častice na overenie kľúčových mutácií v neutralizačnom teste.Rozhodli sme sa overiť mutácie, o ktorých sa predpokladá, že budú mať väčší vplyv alebo existujú s vysokou frekvenciou v izolátoch SARS-CoV-2 (ako je N439K) v obehu.Každý bod predstavuje násobok zvýšenia strednej inhibičnej koncentrácie (IC50) mutácie vzhľadom na vrchol nezmutovaného divokého typu (WT) obsahujúceho D614G.Modrá prerušovaná čiara 1 predstavuje neutralizačný účinok podobný WT a hodnota > 1 predstavuje zvýšený neutralizačný odpor.Farba bodky označuje, či chcete uniknúť z mapy.Bodky označujú, že keďže IC50 je mimo použitej série riedení, kontroluje sa viacnásobná zmena (horná alebo dolná hranica).Väčšina mutantov sa testuje duplicitne, takže existujú dva body.Kompletná neutralizačná krivka je znázornená na obrázku 2. S3.Jednopísmenové skratky aminokyselinových zvyškov sú nasledovné: A, Ala;C, cysteín;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, jeho;I, Ile;K, lyzín;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gin;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, tryptofán;a Y, Tyr.
Aby sme overili antigénny účinok kľúčových mutácií, vykonali sme neutralizačný test s použitím panicle pseudotypovaných lentivírusových častíc a zistili sme, že existuje konzistentnosť medzi únikovou mapou väzby protilátky a neutralizačným testom (obrázok 1C a obrázok S3).Ako sa očakávalo z mapy protilátok REGN-COV2, mutácia v polohe 486 je neutralizovaná iba pomocou REGN10933, zatiaľ čo mutácia v polohách 439 a 444 je neutralizovaná iba pomocou REGN10987, takže tieto mutácie nemôžu uniknúť.Ale E406W unikol dvom protilátkam REGN-COV2, takže tiež silne unikol zo zmesi.Prostredníctvom štrukturálnej analýzy a selekcie úniku vírusu Regeneron verí, že žiadna mutácia jednej aminokyseliny nemôže uniknúť dvom protilátkam v kokteile (11, 12), ale naša kompletná mapa identifikuje E406W ako mutáciu úniku koktailu.E406W ovplyvňuje protilátku REGN-COV2 relatívne špecifickým spôsobom a vážne neinterferuje s funkciou RBD, pretože len mierne znižuje neutralizačný účinok LY-CoV016 (obrázok 1C) a titer špikových pseudotypových lentivírusových častíc (obrázok S3F).
Aby sme preskúmali, či je naša úniková mapa v súlade s vývojom vírusov pri selekcii protilátok, najprv sme skontrolovali údaje experimentu selekcie vírusu Regeneron, v ktorom bol expresný hrot pestovaný v bunkovej kultúre v prítomnosti akéhokoľvek REGN10933 The vezicular vírus stomatitídy (VSV), REGN10987 alebo REGN-COV2 koktail (12).Táto práca identifikovala päť únikových mutácií z REGN10933, dve únikové mutácie z REGN10987 a žiadne mutácie z koktailu (obrázok 2A).Mutácie vybrané všetkými siedmimi bunkovými kultúrami sú zvýraznené na našej únikovej mape a dostupná je aj jednonukleotidová zmena kodónu divokého typu v sekvencii Wuhan-Hu-1 RBD (obrázok 2B), čo naznačuje rozdiel medzi únikovou zhodou. graf a vývoj vírusu pod tlakom protilátky v bunkovej kultúre.Stojí za zmienku, že E406W nie je možné získať zmenami jedného nukleotidu, čo môže vysvetľovať, prečo ho výber koktailu Regeneron nedokáže identifikovať napriek relatívne dobrej tolerancii skladania RBD a afinity ACE2.
(A) V prítomnosti protilátok Regeneron používa panikulový pseudotyp VSV na selekciu mutácií unikajúcich vírusu v bunkovej kultúre (12).(B) Únikový diagram, ako je znázornený na obrázku 1A, ale zobrazuje iba mutácie dostupné jedinou nukleotidovou zmenou v sekvencii Wuhan-Hu-1.Ak nie je sivá, označuje mutácie v bunkovej kultúre (červená) a infikovaných pacientov (modrá) alebo oboje (fialová).Obrázok S5 ukazuje tieto grafy, ktoré sú zafarbené podľa toho, ako mutácie ovplyvňujú afinitu ACE2 alebo expresiu RBD.(C) Kinetika mutácie RBD u pacientov liečených REGN-COV2 v 145. deň infekcie (čierna bodkovaná zvislá čiara).Frekvencia prepojenia medzi E484A a F486I sa zvýšila, ale keďže E484A nie je únikovou mutáciou na našom obrázku, nie je znázornená na iných paneloch.Pozri tiež obrázok.S4.(D) Únikové mutácie, ktoré sa vyskytujú v bunkovej kultúre a infikovaných pacientoch, sú prístupné jediným nukleotidom a naviazanie únikových protilátok nespôsobuje žiadne veľké náklady na afinitu ACE2 [merané metódou zobrazenia kvasiniek (7)].Každý bod je mutácia a jeho tvar a farba indikujú, či je možné k nemu pristupovať a vybrať ho počas rastu vírusu.Čím viac bodov vpravo na osi x indikuje silnejší únik väzby protilátky;vyššie body na osi y označujú vyššiu afinitu ACE2.
Aby sme zistili, či Escape Atlas dokáže analyzovať vývoj vírusov infikujúcich ľudí, skúmali sme údaje o hlbokom sekvenovaní od trvalo infikovaného pacienta s oslabenou imunitou, ktorý dostal REGN-COV2 145. deň po diagnostikovaní liečby COVID-19 (16).Neskorá liečba umožňuje vírusovej populácii pacienta akumulovať genetickú diverzitu, z ktorých niektoré môžu byť poháňané imunitným stresom, pretože pacient má pred liečbou slabú autoneutralizačnú protilátkovú odpoveď (16).Po podaní REGN-COV2 sa frekvencia piatich aminokyselinových mutácií v RBD rýchlo zmenila (obrázok 2C a obrázok S4).Naša úniková mapa ukázala, že tri z týchto mutácií unikli REGN10933 a jedna unikla REGN10987 (obrázok 2B).Stojí za zmienku, že po ošetrení protilátkou neboli všetky mutácie prenesené na fixné miesto.Naopak, dochádza k nárastu a poklesu konkurencie (obrázok 2C).Tento vzor bol pozorovaný vo vnútornom vývoji adaptívnych hostiteľov iných vírusov (17, 18), pravdepodobne kvôli konkurencii medzi genetickými parazitmi a vírusovými líniami.Zdá sa, že obe tieto sily zohrávajú úlohu u pacientov s pretrvávajúcou infekciou (obrázok 2C a obrázok S4C): E484A (nie je to úniková mutácia v našom diagrame) a F486I (únik REGN10933) voľne jazdiace po liečbe a vírusové línie nesúce N440D a Q493K (unikajúci z REGN10987 a REGN10933, v tomto poradí) najskôr súťažil s únikovým mutantom REGN10933 Y489H a potom súťažil s líniou nesúcou E484A a F486I a Q493K.
Tri zo štyroch únikových mutácií u pacientov liečených REGN-COV2 neboli identifikované pri výbere bunkovej kultúry vírusu Regeneron (obrázok 2B), čo ilustruje výhodu úplnej mapy.Výber vírusov je neúplný, pretože môžu identifikovať iba náhodne vybrané mutácie v tomto konkrétnom experimente s bunkovou kultúrou.Naopak, úplná mapa anotuje všetky mutácie, ktoré môžu zahŕňať mutácie spôsobené príčinami, ktoré nesúvisia s liečbou, ale náhodne ovplyvňujú väzbu protilátky.
Evolúciu vírusov samozrejme ovplyvňujú funkčné obmedzenia a tlak na vyhýbanie sa protilátkam.Mutácie a pacienti vybraní v bunkovej kultúre vždy spĺňajú nasledujúce kritériá: unikajú väzbe protilátky, môžu vstúpiť prostredníctvom jedinej zmeny nukleotidu a majú malé alebo žiadne náklady na afinitu ACE2 [cez predchádzajúce hlboké mutácie zobrazené pomocou merania RBD skenovaním kvasiniek (7 )] (obrázok 2D a obrázok S5).Na posúdenie možných ciest vývoja vírusu sa preto môže použiť úplná mapa toho, ako mutácie ovplyvňujú kľúčové biochemické fenotypy RBD (ako je väzba ACE a protilátky).Jednou z výhrad je, že v dlhšom evolučnom časovom rámci, ako je pozorované pri vírusovej imunite a úniku lieku, sa v dôsledku epistatických interakcií môže zmeniť tolerančný priestor pre mutácie (19-21).
Kompletná mapa nám umožňuje vyhodnotiť existujúce únikové mutácie v cirkulujúcom SARS-CoV-2.Skontrolovali sme všetky dostupné sekvencie SARS-CoV-2 odvodené od človeka k 11. januáru 2021 a zistili sme, že veľké množstvo mutácií RBD uniklo jednej alebo viacerým protilátkam (obrázok 3).Avšak jedinou únikovou mutáciou prítomnou v > 0,1 % sekvencie je REGN10933 únikový mutant Y453F [0,3 % sekvencie;pozri (12)], REGN10987 únikový mutant N439K [1,7 % sekvencie;pozri obrázok 1C a (22)] a LY-CoV016 úniková mutácia K417N (0,1 % sekvencia; pozri tiež obrázok 1C).Y453F je spojená s nezávislými ohniskami súvisiacimi s norkovými farmami v Holandsku a Dánsku (23, 24);stojí za zmienku, že samotná norková sekvencia niekedy obsahuje iné únikové mutácie, ako napríklad F486L (24).N439K je v Európe veľmi populárny a tvorí veľkú časť sekvencie zo Škótska a Írska v Európe (22, 25).K417N existuje v línii B.1.351 prvýkrát objavenej v Južnej Afrike (10).Ďalšou v súčasnosti znepokojujúcou mutáciou je N501Y, ktorá je prítomná v B.1.351 a tiež v línii B.1.1.7 pôvodne identifikovanej v Spojenom kráľovstve (9).Naša mapa ukazuje, že N501Y nemá žiadny vplyv na protilátku REGN-COV2, ale iba mierny účinok na LY-CoV016 (obrázok 3).
Pre každú protilátku alebo kombináciu protilátok je k 11. januáru 2021 medzi 317 866 vysokokvalitnými sekvenciami SARS-CoV-2 odvodenými od človeka na GISAID (26) vzťah medzi únikovým skóre pre každú mutáciu a jej frekvenciou.Je označený.Mutácia E406W pre únik koktailu REGN-COV2 vyžaduje viaceré nukleotidové zmeny v sekvencii Wuhan-Hu-1 RBD a nie je pozorovaná v sekvencii GISAID.Ďalšie mutácie zvyšku E406 (E406Q a E406D) boli pozorované s nízkou frekvenciou, ale tieto mutantné aminokyseliny nie sú jednonukleotidové mutácie ďaleko od W.
Ako sa očakávalo, únikové mutácie sa zvyčajne vyskytujú na rozhraní protilátka-RBD.Samotná štruktúra však nestačí na predpovedanie, ktoré mutácie sprostredkujú únik.Napríklad LY-CoV016 využíva svoje ťažké a ľahké reťazce na naviazanie sa na široký epitop, ktorý prekrýva väzbový povrch ACE2, ale proces úniku zahŕňa mutácie vo zvyškoch RBD v oblasti určujúcej komplementaritu ťažkého reťazca (obrázok 4A a obrázok S6, E až G).Naopak, úniky z REGN10933 a REGN10987 sa vyskytli hlavne na zvyškoch RBD naskladaných na rozhraní ťažkých a ľahkých reťazcov protilátky (obrázok 4A a obrázok S6, A až D).Mutácia E406W, ktorá unikla zo zmesi REGN-COV2, sa vyskytla na zvyškoch, ktoré neboli v kontakte ani s jednou protilátkou (obrázok 4, A a B).Aj keď je E406 štrukturálne bližšie k LY-CoV016 (obrázok 4B a obrázok S6H), mutácia E406W má oveľa menší účinok na protilátku (obrázok 1, B a C), čo naznačuje, že špecifický štrukturálny mechanizmus s dlhým dosahom je anti-REGN - protilátka COV2 (obrázok S6I).Stručne povedané, mutácie na zvyškoch RBD v kontakte s protilátkami nie vždy sprostredkujú únik a niektoré významné únikové mutácie sa vyskytujú na zvyškoch, ktoré nie sú v kontakte s protilátkami (obrázok 4B a obrázok S6, D a G).
(A) Únikový diagram premietaný na štruktúru RBD viazanú protilátkou.[REGN10933 a REGN10987: Proteínová databáza (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].Variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca protilátky sú zobrazené ako modré karikatúry a farba na povrchu RBD označuje silu úniku sprostredkovaného mutáciou na tomto mieste (biela označuje žiadny únik a červená označuje najsilnejšiu únikové miesto protilátky alebo zmesi).Stránky, ktoré nie sú funkčne zmutované, sú sivé.(B) Pre každú protilátku klasifikujte miesto ako priamy kontakt protilátky (nevodíkové atómy v rámci 4Á protilátky), proximálna protilátka (4 až 8Á) alebo distálna protilátka (> 8Á).Každý bod predstavuje lokalitu, ktorá je rozdelená na únikovú (červená) alebo neunikajúcu (čierna).Sivá prerušovaná čiara predstavuje kritickú hodnotu použitú na klasifikáciu lokality ako únikovej alebo neúnikovej (podrobnosti nájdete v časti Materiály a metódy).Červené a čierne čísla označujú, koľko stránok v každej kategórii bolo uniknutých alebo nekódovaných.
V tejto štúdii sme kompletne zmapovali mutácie, ktoré obchádzajú tri hlavné protilátky proti SARS-CoV-2.Tieto mapy naznačujú, že predchádzajúca charakterizácia únikových mutácií je neúplná.Neboli identifikované ani mutácie jednej aminokyseliny, ktoré môžu uniknúť dvom protilátkam v kokteile REGN-COV2, ani neidentifikovali väčšinu pacientov s pretrvávajúcou infekciou liečených kokteilom.mutácia.Samozrejme, naša mapa ešte nezodpovedala najpálčivejšiu otázku: Vyvinie si SARS-CoV-2 rozsiahlu rezistenciu voči týmto protilátkam?Isté však je, že je znepokojujúce, že toľko únikových mutácií má malý vplyv na skladanie RBD alebo receptorovú afinitu a v cirkulujúcich vírusoch už existujú nejaké mutácie na nízkej úrovni.Nakoniec je potrebné počkať a pozorovať, aké mutácie SARS-CoV-2 prenesie, keď sa rozšíri medzi populáciu.Naša práca pomôže „pozorovaniu“ okamžitým vysvetlením vplyvu mutácií klasifikovaných sledovaním vírusového genómu.
Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný za podmienok licencie Creative Commons Attribution License.Článok umožňuje neobmedzené používanie, distribúciu a reprodukciu na akomkoľvek médiu za predpokladu, že je správne citované pôvodné dielo.
Poznámka: Uveďte svoju e-mailovú adresu iba preto, aby osoba, ktorú odporúčate na stránku, vedela, že chcete, aby e-mail videla a že nejde o spam.Nebudeme zachytávať žiadne e-mailové adresy.
Táto otázka sa používa na testovanie, či ste návštevník a na zabránenie automatickému odosielaniu spamu.
Hrajú: Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Kompletná mapa mutácií SARS-CoV-2, ktoré unikli zmesi monoklonálnych protilátok Regeneron, pomáha vysvetliť vývoj vírusu pri liečbe pacientov.
Hrajú: Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Kompletná mapa mutácií SARS-CoV-2, ktoré unikli zmesi monoklonálnych protilátok Regeneron, pomáha vysvetliť vývoj vírusu pri liečbe pacientov.
©2021 American Association for the Advancement of Science.všetky práva vyhradené.AAAS je partnerom spoločností HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Čas odoslania: 24. februára 2021