Več protiteles se že uporablja ali razvija kot terapije za zdravljenje COVID-19.Ob pojavu novih različic hudega akutnega respiratornega sindroma koronavirus 2 (SARS-CoV-2) je pomembno predvideti, ali bodo še vedno dovzetni za zdravljenje s protitelesi.Starr et al.Uporabljena je bila knjižnica kvasovk, ki zajema vse mutacije v vezni domeni receptorja SARS-CoV-2, ki ne bodo močno motile vezave na gostiteljski receptor (ACE2), in zemljevid, kako te mutacije vplivajo na tri glavne anti-SARS-CoV -2 vezava protiteles.Te številke identificirajo mutacije, ki uidejo vezavi protiteles, vključno z enojnimi mutacijami, ki uidejo dvema protitelesoma v mešanici protiteles Regeneron.Številne mutacije, ki uidejo enemu samemu protitelesu, se širijo pri ljudeh.
Protitelesa so možna terapija za zdravljenje hudega akutnega respiratornega sindroma koronavirus 2 (SARS-CoV-2), vendar ni jasno, ali se virus razvije, da bi se izognil njihovemu tveganju.Tukaj prikazujemo, kako vse mutacije v vezavni domeni receptorja SARS-CoV-2 (RBD) vplivajo na vezavo koktajla REGN-COV2 na protitelo LY-CoV016.Ti popolni zemljevidi so razkrili mutacijo aminokislin, ki se je popolnoma izognila mešanici REGN-COV2, ki je sestavljena iz dveh protiteles REGN10933 in REGN10987, ki ciljata na različne strukturne epitope.Te številke identificirajo tudi virusne mutacije, izbrane pri dolgotrajno okuženih bolnikih, zdravljenih z REGN-COV2, in med in vitro selekcijo uhajanja virusa.Končno te številke razkrivajo, da so mutacije, ki uidejo enemu protitelesu, že prisotne v krožečih sevih SARS-CoV-2.Ti popolni zemljevidi pobega lahko pojasnijo posledice mutacij, opaženih med nadzorom virusa.
Razvijajo se protitelesa za zdravljenje hudega akutnega respiratornega sindroma koronavirus 2 (SARS-CoV-2) (1).Protitelesa proti nekaterim drugim virusom lahko postanejo neučinkovita zaradi virusnih mutacij, izbranih med zdravljenjem okuženih bolnikov (2, 3), ali virusnih mutacij, ki so se razširile po vsem svetu in dale odpornost celotnemu virusnemu kladu.Zato je določitev, katere mutacije SARS-CoV-2 lahko uidejo ključnim protitelesom, ključnega pomena za oceno, kako mutacije, opažene med nadzorom virusa, vplivajo na učinkovitost terapije s protitelesi.
Večina vodilnih protiteles proti SARS-CoV-2 cilja na vezavno domeno virusnega receptorja (RBD), ki posreduje pri vezavi na receptor angiotenzinske konvertaze 2 (ACE2) (5, 6).Pred kratkim smo razvili metodo globokega skeniranja mutacij, da bi preslikali, kako vse mutacije RBD vplivajo na njegovo delovanje in prepoznavanje s protivirusnimi protitelesi (7, 8).Metoda vključuje ustvarjanje knjižnice mutantov RBD, njihovo izražanje na površini kvasovk in uporabo fluorescenčno aktiviranega razvrščanja celic in globokega sekvenciranja za kvantificiranje, kako vsaka mutacija vpliva na zvijanje RBD, afiniteto ACE2 (merjeno v nizu titracij) in vezavo protiteles. (Slika S1A).V tej študiji smo uporabili ponavljajočo se mutantno knjižnico, opisano v (7), ki je sestavljena iz različic RBD s črtno kodo, ki pokrivajo 3804 od 3819 možnih mutacij aminokislin.Naša knjižnica je bila pripravljena iz genetskega ozadja RBD zgodnjega izolata Wuhan-Hu-1.Čeprav pogostost več mutantov narašča, še vedno predstavljajo najpogostejša zaporedja RBD (9, 10).Narisali smo dve od 2034 mutacij, ki ne motita močno zvijanja RBD in vezave ACE (7) kako prenesti koktajl REGN-COV2 (REGN10933 in REGN10987) (11, 12) in LY-CoV016 Eli Lilly Rekombinantna oblika protitelo vpliva na način vezave protitelesa (imenovano tudi CB6 ali JS016) (13) (slika S1B).REGN-COV2 je nedavno dobil dovoljenje za nujno uporabo za COVID-19 (14), medtem ko je LY-CoV016 trenutno v fazi 3 kliničnih preskušanj (15).
[Glu406→Trp(E406W)] se je močno izognil mešanici dveh protiteles (slika 1A).Zemljevid pobega LY-CoV016 je razkril tudi številne ubežne mutacije na različnih mestih v RBD (slika 1B).Čeprav lahko nekatere ubežne mutacije oslabijo sposobnost RBD, da se veže na ACE2 ali izraža v ustrezno zviti obliki, glede na predhodne meritve skeniranja globokih mutacij z uporabo RBD, prikazanega s kvasovkami, imajo številne funkcionalne mutacije le malo ali nič vpliva na te funkcionalne lastnosti (7 ) (Slika 1, A in B predstavljata izgubo afinitete ACE2, medtem ko slika S2 predstavlja zmanjšanje izražanja RBD.
(A) Preslikava protitelesa v REGN-COV2.Črtni graf na levi prikazuje umik na vsakem mestu v RBD (vsota vseh mutacij na vsakem mestu).Slika logotipa na desni prikazuje močno lokacijo pobega (vijolično podčrtano).Višina vsake črke je sorazmerna z močjo pobega, ki ga posreduje mutacija aminokisline, in "rezultat pobega" 1 za vsako mutacijo ustreza popolnemu pobegu.Lestvica osi y je drugačna za vsako vrstico, tako da na primer E406W uide vsem protitelesom REGN, vendar je to najbolj očitno pri koktajlih, ker ga preplavijo druga mesta uhajanja posameznih protiteles.Za razširljivo različico se S2, A in B uporabljajo za barvanje zemljevida glede na to, kako mutacije vplivajo na izražanje zloženega RBD.S2, C in D se uporabljajo za porazdelitev vpliva na afiniteto ACE2 in izražanje RBD med vsemi mutacijami, opaženimi v krožečih izolatih virusa.(B) Kot je prikazano v (A), narišite LY-CoV016.(C) Uporabite psevdotipizirane lentivirusne delce, da preverite ključne mutacije v nevtralizacijskem testu.Odločili smo se, da preverimo mutacije, za katere se predvideva, da bodo imele večji vpliv ali bodo obstajale z visoko frekvenco v izolatih SARS-CoV-2 (kot je N439K) v obtoku.Vsaka točka predstavlja kratno povečanje mediane inhibitorne koncentracije (IC50) mutacije glede na vrh nemutiranega divjega tipa (WT), ki vsebuje D614G.Modra črtkana črta 1 predstavlja učinek nevtralizacije, podoben WT, vrednost > 1 pa predstavlja povečano odpornost na nevtralizacijo.Barva pike označuje, ali želite pobegniti z zemljevida.Pike pomenijo, da je IC50 izven uporabljene serije redčenja, zato se preveri večkratna sprememba (zgornja ali spodnja meja).Večina mutantov je testiranih v dvojniku, tako da obstajata dve točki.Celotna nevtralizacijska krivulja je prikazana na sliki 2. S3.Enočrkovne okrajšave aminokislinskih ostankov so naslednje: A, Ala;C, cistein;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, njegov;jaz, Ile;K, lizin;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, triptofan;in Y, Tyr.
Da bi preverili antigenski učinek ključnih mutacij, smo izvedli nevtralizacijski test z uporabo psevdotipiziranih lentivirusnih delcev mehurčkov in ugotovili, da obstaja skladnost med zemljevidom uhajanja vezave protiteles in nevtralizacijskim testom (slika 1C in slika S3).Kot je pričakovano na zemljevidu protiteles REGN-COV2, je mutacija na položaju 486 nevtralizirana samo z REGN10933, medtem ko je mutacija na mestih 439 in 444 nevtralizirana samo z REGN10987, tako da te mutacije ne morejo uiti.Toda E406W je ušel obema protitelesoma REGN-COV2, tako da je močno ušel tudi mešanici.Regeneron meni, da s strukturno analizo in selekcijo ubežnega virusa nobena posamezna aminokislinska mutacija ne more uiti dvema protitelesoma v koktajlu (11, 12), vendar naš celoten zemljevid identificira E406W kot mutacijo ubežnega koktajla.E406W vpliva na protitelo REGN-COV2 na sorazmerno specifičen način in resno ne moti delovanja RBD, ker le rahlo zmanjša nevtralizacijski učinek LY-CoV016 (slika 1C) in titer psevdotipiziranih lentivirusnih delcev s koničastim nabojem (slika S3F).
Da bi raziskali, ali je naš zemljevid pobega skladen z razvojem virusov pri selekciji protiteles, smo najprej preverili podatke poskusa selekcije pobega virusa Regeneron, v katerem je bila ekspresijska konica gojena v celični kulturi v prisotnosti katerega koli REGN10933 vezikularnega virus stomatitisa (VSV), koktajl REGN10987 ali REGN-COV2 (12).To delo je identificiralo pet ubežnih mutacij iz REGN10933, dve ubežni mutaciji iz REGN10987 in nobene mutacije iz koktajla (slika 2A).Mutacije, ki jih je izbralo vseh sedem celičnih kultur, so poudarjene na našem zemljevidu pobegov, dostopna pa je tudi sprememba enega nukleotida kodona divjega tipa v zaporedju Wuhan-Hu-1 RBD (slika 2B), kar kaže na razliko med pobegi. graf in razvoj virusa pod pritiskom protiteles v celični kulturi.Treba je omeniti, da do E406W ni mogoče dostopati s spremembami posameznega nukleotida, kar lahko pojasni, zakaj ga izbor koktajla Regeneron ne more identificirati kljub razmeroma dobri toleranci zvijanja RBD in afinitete ACE2.
(A) V prisotnosti protiteles Regeneron uporablja psevdotip VSV mešička za izbiro mutacij, ki so ubežale virusu v celični kulturi (12).(B) Diagram pobega, kot je prikazan na sliki 1A, vendar prikazuje samo mutacije, ki so dostopne z eno samo nukleotidno spremembo v zaporedju Wuhan-Hu-1.Nesivo označuje mutacije v celični kulturi (rdeče) in okužene bolnike (modro)) ali oboje (vijolično).Slika S5 prikazuje te grafe, ki so obarvani glede na to, kako mutacije vplivajo na afiniteto ACE2 ali izražanje RBD.(C) Kinetika mutacije RBD pri bolnikih, zdravljenih z REGN-COV2 na 145. dan okužbe (črna pikčasta navpična črta).Pogostost povezave med E484A in F486I se je povečala, a ker E484A na naši sliki ni ubežna mutacija, ni prikazana na drugih ploščah.Glej tudi sliko.S4.(D) Ubežne mutacije, ki se pojavijo v celični kulturi in okuženih bolnikih, so dostopne z enim samim nukleotidom in vezava ubežnih protiteles ne povzroči večjih stroškov za afiniteto ACE2 [izmerjeno z metodo prikaza kvasovk (7)].Vsaka točka je mutacija, njena oblika in barva pa kažeta, ali je do nje mogoče dostopati in jo izbrati med rastjo virusa.Več desnih točk na osi x kaže na močnejši pobeg protiteles;višje točke na y-osi kažejo večjo afiniteto za ACE2.
Da bi ugotovili, ali lahko Escape Atlas analizira razvoj virusov, ki okužijo ljudi, smo preučili podatke globokega sekvenciranja vztrajno okuženega imunsko oslabelega bolnika, ki je prejel REGN-COV2 145. dan po diagnozi zdravljenja COVID-19 (16).Pozno zdravljenje omogoča, da bolnikova virusna populacija kopiči genetsko raznolikost, ki je lahko posledica imunskega stresa, ker ima bolnik pred zdravljenjem šibek odziv avtonevtralizirajočih protiteles (16).Po dajanju REGN-COV2 se je pogostost petih mutacij aminokislin v RBD hitro spremenila (slika 2C in slika S4).Naš zemljevid pobega je pokazal, da so tri od teh mutacij ušle REGN10933 in ena REGN10987 (slika 2B).Omeniti velja, da po zdravljenju s protitelesi vse mutacije niso bile prenesene na fiksno mesto.Ravno nasprotno, prihaja do vzpona in padca konkurence (slika 2C).Ta vzorec je bil opažen v notranjem razvoju prilagodljivih gostiteljev drugih virusov (17, 18), verjetno zaradi tekmovanja med genetskim prostim jahanjem in virusnimi linijami.Zdi se, da imata obe sili pomembno vlogo pri bolnikih s trdovratno okužbo (slika 2C in slika S4C): E484A (ni ubežna mutacija v našem diagramu) in F486I (ubežna REGN10933), ki po zdravljenju prosto potujeta, in virusne linije, ki prenašajo N440D in Q493K (ubežni REGN10987 oziroma REGN10933) je najprej tekmoval z REGN10933 ubežnim mutantom Y489H, nato pa je tekmoval z linijo, ki nosi E484A in F486I ter Q493K.
Tri od štirih ubežnih mutacij pri bolnikih, zdravljenih z REGN-COV2, niso bile ugotovljene pri izbiri celične kulture virusa Regeneron (slika 2B), kar ponazarja prednost celotnega zemljevida.Izbira virusa je nepopolna, ker lahko prepoznajo samo vse mutacije, naključno izbrane v tem določenem poskusu celične kulture.Nasprotno, celoten zemljevid označuje vse mutacije, ki lahko vključujejo mutacije, ki jih povzročijo razlogi, ki niso povezani z zdravljenjem, vendar po nesreči vplivajo na vezavo protiteles.
Seveda pa na razvoj virusov vplivajo funkcionalne omejitve in pritisk, da se izognemo protitelesom.Mutacije in bolniki, izbrani v celični kulturi, vedno izpolnjujejo naslednja merila: izognejo se vezavi protiteles, lahko vstopijo z eno samo spremembo nukleotida in imajo malo ali nič stroškov za afiniteto ACE2 [prek prejšnjih globokih mutacij, prikazanih z uporabo kvasovk Skeniranje meritev RBD (7 )] (Slika 2D in Slika S5).Zato je mogoče uporabiti popoln zemljevid, kako mutacije vplivajo na ključne biokemične fenotipe RBD (kot sta ACE in vezava protiteles), da ocenimo možne poti za razvoj virusa.Eno opozorilo je, da se lahko v daljšem evolucijskem časovnem okviru, kot opazimo pri virusni imunosti in umiku zdravil, zaradi epistatičnih interakcij tolerančni prostor za mutacije spremeni (19–21).
Celoten zemljevid nam omogoča, da ocenimo obstoječe ubežne mutacije v krožečem SARS-CoV-2.Od 11. januarja 2021 smo preverili vse razpoložljive sekvence SARS-CoV-2, pridobljene pri ljudeh, in ugotovili, da je veliko število mutacij RBD ušlo enemu ali več protitelesom (slika 3).Vendar je edina ubežna mutacija, prisotna v >0,1 % zaporedja, REGN10933 ubežni mutant Y453F [0,3 % zaporedja;glej (12)], REGN10987 ubežni mutant N439K [1,7 % zaporedja;glej sliko 1C in (22)], in ubežno mutacijo LY-CoV016 K417N (0,1 % zaporedje; glej tudi sliko 1C).Y453F je povezan z neodvisnimi izbruhi, povezanimi s farmami kun na Nizozemskem in Danskem (23, 24);treba je omeniti, da samo zaporedje kun včasih vsebuje druge ubežne mutacije, kot je F486L (24).N439K je zelo priljubljen v Evropi in predstavlja velik del zaporedja iz Škotske in Irske v Evropi (22, 25).K417N obstaja v liniji B.1.351, ki je bila prvič odkrita v Južni Afriki (10).Druga trenutno zaskrbljujoča mutacija je N501Y, ki je prisotna v B.1.351 in tudi v liniji B.1.1.7, prvotno ugotovljeni v Združenem kraljestvu (9).Naš zemljevid kaže, da N501Y ne vpliva na protitelesa REGN-COV2, ampak le zmerno vpliva na LY-CoV016 (slika 3).
Za vsako protitelo ali kombinacijo protiteles je od 11. januarja 2021 med 317.866 visokokakovostnimi sekvencami SARS-CoV-2, pridobljenimi od človeka, na GISAID (26) razmerje med izhodnim rezultatom za vsako mutacijo in njeno pogostnostjo.Označeno je.Ubežna mutacija koktajla REGN-COV2 E406W zahteva večkratne spremembe nukleotidov v zaporedju Wuhan-Hu-1 RBD in ni opažena v zaporedju GISAID.Druge mutacije ostanka E406 (E406Q in E406D) so opazili z nizkofrekvenčnim štetjem, vendar te mutirane aminokisline niso mutacije enega nukleotida daleč od W.
Kot je bilo pričakovano, se ubežne mutacije običajno pojavijo v vmesniku protitelo-RBD.Vendar pa sama struktura ni dovolj za napovedovanje, katere mutacije posredujejo pri pobegu.Na primer, LY-CoV016 uporablja svoje težke in lahke verige za vezavo na širok epitop, ki prekriva vezavno površino ACE2, vendar proces uhajanja vključuje mutacije v ostankih RBD v regiji, ki določa komplementarnost težke verige (slika 4A in slika S6, E do G).Nasprotno pa je do uhajanja REGN10933 in REGN10987 v glavnem prišlo pri ostankih RBD, ki so bili zloženi na vmesniku težkih in lahkih verig protiteles (slika 4A in slika S6, od A do D).Mutacija E406W, ki je ušla zmesi REGN-COV2, se je pojavila na ostankih, ki niso bili v stiku z nobenim protitelesom (slika 4, A in B).Čeprav je E406 strukturno bližje LY-CoV016 (slika 4B in slika S6H), ima mutacija E406W veliko manjši učinek na protitelo (slika 1, B in C), kar kaže, da je specifični strukturni mehanizem dolgega dosega anti-REGN - Protitelesa COV2 (slika S6I).Če povzamemo, mutacije na ostankih RBD v stiku s protitelesi ne posredujejo vedno pri pobegu in nekatere pomembne ubežne mutacije se pojavijo na ostankih, ki niso v stiku s protitelesi (slika 4B in slika S6, D in G).
(A) Diagram pobega, projiciran na strukturo RBD, ki jo veže protitelo.[REGN10933 in REGN10987: Protein Database (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].Variabilne domene težke in lahke verige protitelesa so prikazane kot modre risbe, barva na površini RBD pa označuje moč pobega, ki ga povzroči mutacija, na tem mestu (bela pomeni, da pobega ni, rdeča pa najmočnejšega mesto uhajanja protitelesa ali mešanice).Spletna mesta, ki niso funkcionalno spremenjena, so zatemnjena.(B) Za vsako protitelo razvrstite mesto kot neposredni stik s protitelesom (nevodikovi atomi znotraj 4 Å od protitelesa), proksimalno protitelo (4 do 8 Å) ali distalno protitelo (> 8 Å).Vsaka točka predstavlja mesto, razdeljeno na pobeg (rdeča) ali nepobeg (črna).Siva črtkana črta predstavlja kritično vrednost, ki se uporablja za razvrstitev mesta kot escape ali non escape (za podrobnosti glejte Materiali in metode).Rdeče in črne številke označujejo, koliko mest v vsaki kategoriji je ubežnih ali neubežnih.
V tej študiji smo v celoti preslikali mutacije, ki se izognejo trem glavnim protitelesom proti SARS-CoV-2.Ti zemljevidi kažejo, da je prejšnja karakterizacija ubežnih mutacij nepopolna.Identificirane niso bile niti posamezne aminokislinske mutacije, ki lahko uidejo dvema protitelesoma v koktajlu REGN-COV2, niti niso identificirali večine bolnikov s trdovratno okužbo, zdravljenih s koktajlom.mutacija.Seveda naš zemljevid še ni odgovoril na najbolj pereče vprašanje: Ali bo SARS-CoV-2 razvil obsežno odpornost na ta protitelesa?Gotovo pa je, da je zaskrbljujoče, da ima toliko ubežnih mutacij majhen učinek na zvijanje RBD ali afiniteto za receptorje in že obstaja nekaj mutacij na nizki ravni v krožečih virusih.Na koncu je treba počakati in opazovati, kakšne mutacije bo prenašal SARS-CoV-2, ko se bo razširil med prebivalstvom.Naše delo bo pomagalo pri »opazovanju« s takojšnjo razlago vpliva mutacij, razvrščenih z nadzorom virusnega genoma.
To je članek z odprtim dostopom, ki se distribuira pod pogoji licence Creative Commons Attribution.Članek dovoljuje neomejeno uporabo, distribucijo in reproduciranje v kateremkoli mediju pod pogojem, da je izvirno delo pravilno citirano.
Opomba: Prosimo vas samo, da navedete svoj e-poštni naslov, da oseba, ki jo priporočite na strani, ve, da želite, da vidi e-pošto in da ni vsiljena pošta.E-poštnih naslovov ne bomo zajeli.
To vprašanje se uporablja za preverjanje, ali ste obiskovalec, in preprečevanje samodejnega pošiljanja neželene pošte.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Celoten zemljevid mutacij SARS-CoV-2, ki uidejo mešanici monoklonskih protiteles Regeneron, pomaga razložiti razvoj virusa pri zdravljenju bolnikov.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Celoten zemljevid mutacij SARS-CoV-2, ki uidejo mešanici monoklonskih protiteles Regeneron, pomaga razložiti razvoj virusa pri zdravljenju bolnikov.
©2021 Ameriško združenje za napredek znanosti.vse pravice pridržane.AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef in COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Čas objave: 24. februarja 2021