Неколико антитела је већ у употреби или је у развоју као терапија за лечење ЦОВИД-19.Са појавом нових варијанти тешког акутног респираторног синдрома коронавируса 2 (САРС-ЦоВ-2), важно је предвидети да ли ће они и даље бити подложни терапији антителима.Старр ет ал.Коришћена је библиотека квасца која покрива све мутације у домену везивања рецептора САРС-ЦоВ-2 које неће снажно пореметити везивање за рецептор домаћина (АЦЕ2) и мапирати како ове мутације утичу на три главна анти-САРС-ЦоВ -2 везивање антитела.Ове бројке идентификују мутације које избегавају везивање антитела, укључујући појединачне мутације које избегавају два антитела у мешавини Регенерон антитела.Многе мутације које избегну једно антитело се шире код људи.
Антитела су потенцијална терапија за лечење тешког акутног респираторног синдрома коронавируса 2 (САРС-ЦоВ-2), али није јасно да ли се вирус развија да би избегао њихов ризик.Овде приказујемо како све мутације у домену везивања рецептора САРС-ЦоВ-2 (РБД) утичу на везивање РЕГН-ЦОВ2 коктела за антитело ЛИ-ЦоВ016.Ове комплетне мапе су откриле мутацију аминокиселина која је у потпуности избегла мешавину РЕГН-ЦОВ2, која се састоји од два антитела РЕГН10933 и РЕГН10987 која циљају различите структурне епитопе.Ове бројке такође идентификују мутације вируса одабране код перзистентно инфицираних пацијената лечених РЕГН-ЦОВ2 и током ин витро селекције вируса који је побегао.Коначно, ове бројке откривају да су мутације које избегну једно антитело већ присутне у циркулишућим сојевима САРС-ЦоВ-2.Ове комплетне мапе бекства могу објаснити последице мутација уочених током надзора вируса.
Развијају се антитела за лечење тешког акутног респираторног синдрома коронавируса 2 (САРС-ЦоВ-2) (1).Антитела против неких других вируса могу бити неефикасна због мутација вируса одабраних током лечења инфицираних пацијената (2, 3) или вирусних мутација које су се прошириле широм света да би пружиле отпор целој клади вируса.Стога је одређивање које мутације САРС-ЦоВ-2 могу избећи кључна антитела кључно за процену како мутације примећене током надзора вируса утичу на ефикасност терапије антителима.
Већина водећих анти-САРС-ЦоВ-2 антитела циља на домен везивања вирусних рецептора (РБД), који посредује у везивању за рецептор ензима који конвертује ангиотензин 2 (АЦЕ2) (5, 6).Недавно смо развили метод дубоког скенирања мутација да бисмо мапирали како све мутације РБД утичу на његову функцију и препознавање од стране антивирусних антитела (7, 8).Метода укључује креирање библиотеке РБД мутаната, њихово изражавање на површини квасца и коришћење сортирања ћелија активираног флуоресценцијом и дубоког секвенцирања да се квантификује како свака мутација утиче на савијање РБД, АЦЕ2 афинитет (мерен у серији титрације) и везивање антитела. (Слика С1А).У овој студији користили смо библиотеку репетитивних мутаната описану у (7), која се састоји од баркодираних РБД варијанти, које покривају 3804 од 3819 могућих мутација аминокиселина.Наша библиотека је припремљена из РБД генетске позадине раног изолата Вухан-Ху-1.Иако се учесталост неколико мутаната повећава, они и даље представљају најчешће РБД секвенце (9, 10).Нацртали смо две од 2034 мутације које не ремете снажно РБД савијање и АЦЕ везивање (7) како да прође РЕГН-ЦОВ2 коктел (РЕГН10933 и РЕГН10987) (11, 12) и Ели Лилијев ЛИ-ЦоВ016 Рекомбинантни облик антитело утиче на метод везивања антитела (који се назива и ЦБ6 или ЈС016) (13) (слика С1Б).РЕГН-ЦОВ2 је недавно добио дозволу за хитну употребу за ЦОВИД-19 (14), док је ЛИ-ЦоВ016 тренутно у фази клиничких испитивања фазе 3 (15).
[Глу406→Трп(Е406В)] је снажно избегао мешавину два антитела (слика 1А).Мапа бекства ЛИ-ЦоВ016 је такође открила многе мутације бекства на различитим местима у РБД (слика 1Б).Иако неке есцапе мутације могу нарушити способност РБД-а да се веже за АЦЕ2 или да се изрази у одговарајуће пресавијеном облику, према претходним мерењима скенирања дубоких мутација коришћењем РБД-а приказаног квасцем, многе функционалне мутације имају мали или никакав утицај на ова функционална својства (7 ) (Слика 1, А и Б представљају губитак афинитета АЦЕ2, док слика С2 представља смањење експресије РБД-а.
(А) Мапирање антитела у РЕГН-ЦОВ2.Линијски графикон са леве стране приказује бег на сваком месту у РБД (збир свих мутација на сваком месту).Слика логотипа са десне стране показује снажну локацију за бекство (љубичаста доња линија).Висина сваког слова је пропорционална снази бекства посредованог мутацијом аминокиселине, а „оцена бекства“ од 1 за сваку мутацију одговара потпуном бекству.Скала и-осе је другачија за сваки ред, тако да, на пример, Е406В избегава сва РЕГН антитела, али је најочитија за коктеле јер је преплављена другим местима бекства појединачних антитела.За скалабилну верзију, С2, А и Б се користе за бојење мапе према томе како мутације утичу на експресију савијеног РБД-а.С2, Ц и Д се користе за расподелу утицаја на АЦЕ2 афинитет и експресију РБД између свих мутација уочених у циркулишућим изолатима вируса.(Б) Као што је приказано у (А), нацртајте ЛИ-ЦоВ016.(Ц) Користите лентивирусне честице псеудотиповане шиљцима да бисте потврдили кључне мутације у тесту неутрализације.Одлучили смо да проверимо мутације за које се предвиђа да ће имати већи утицај или ће постојати на високој фреквенцији у изолатима САРС-ЦоВ-2 (као што је Н439К) у циркулацији.Свака тачка представља вишеструко повећање средње инхибиторне концентрације (ИЦ50) мутације у односу на врхунац немутираног дивљег типа (ВТ) који садржи Д614Г.Плава испрекидана линија 1 представља ефекат неутрализације сличан ВТ, а вредност> 1 представља повећану отпорност на неутрализацију.Боја тачке означава да ли желите да побегнете са мапе.Тачке означавају да пошто је ИЦ50 изван коришћене серије разблажења, проверава се вишеструка промена (горња или доња граница).Већина мутаната се тестира у дупликату, тако да постоје две тачке.Комплетна крива неутрализације је приказана на слици 2. С3.Једнословне скраћенице аминокиселинских остатака су следеће: А, Ала;Ц, Цистеин;Д, Асп;Е, Глу;Ф, Пхе;Г, Гли;Х, његов;И, Иле;К, лизин;Л, Лиу;Метрополис Н, Асен;П, Про;К, Глн;Р, Арг;С, Сер;Т, Тхр;В, Вал;В, триптофан;и И, Тир.
Да бисмо потврдили антигени ефекат кључних мутација, извршили смо тест неутрализације користећи псеудотиповане лентивирусне честице метлице и открили да постоји конзистентност између мапе евакуације везивања антитела и теста неутрализације (Слика 1Ц и Слика С3).Као што се очекује од карте антитела РЕГН-ЦОВ2, мутацију на позицији 486 неутралише само РЕГН10933, док је мутацију на позицијама 439 и 444 неутралише само РЕГН10987, тако да ове мутације не могу да побегну.Али Е406В је избегао два РЕГН-ЦОВ2 антитела, тако да је такође снажно побегао из мешавине.Кроз структурну анализу и селекцију вируса који побегне, Регенерон верује да ниједна мутација аминокиселина не може да избегне два антитела у коктелу (11, 12), али наша комплетна мапа идентификује Е406В као мутацију која је избегла коктел.Е406В утиче на РЕГН-ЦОВ2 антитело на релативно специфичан начин и не ремети озбиљно функцију РБД, јер само мало смањује ефекат неутрализације ЛИ-ЦоВ016 (слика 1Ц) и титар шиљастих псеудотипизованих лентивирусних честица (слика С3Ф).
Да бисмо истражили да ли је наша есцапе мапа конзистентна са еволуцијом вируса под селекцијом антитела, прво смо проверили податке експеримента селекције Регенерон вируса, у којем је експресиони шиљак узгајан у ћелијској култури у присуству било ког РЕГН10933 везикуларног вирус стоматитиса (ВСВ), РЕГН10987 или РЕГН-ЦОВ2 коктел (12).Овај рад је идентификовао пет мутација бекства из РЕГН10933, две мутације бекства из РЕГН10987 и ниједну мутацију из коктела (слика 2А).Мутације које је одабрало свих седам ћелијских култура истакнуте су у нашој мапи бекства, а такође је доступна и промена једнонуклеотидног кодона дивљег типа у Вухан-Ху-1 РБД секвенци (слика 2Б), што указује на разлику између бекства Конкорданса граф и еволуција вируса под притиском антитела у ћелијској култури.Вреди напоменути да се Е406В не може приступити променама појединачних нуклеотида, што може објаснити зашто селекција Регенерон коктела не може да га идентификује упркос релативно доброј толеранцији савијања РБД и АЦЕ2 афинитета.
(А) У присуству антитела, Регенерон користи псеудотип метлице ВСВ да одабере мутације које избегну вирус у ћелијској култури (12).(Б) Дијаграм бежања, као што је приказано на слици 1А, али приказује само мутације доступне једном променом нуклеотида у секвенци Вухан-Ху-1.Не-сива означава мутације у ћелијској култури (црвена) и заражене пацијенте (плава) ), или обоје (љубичаста).Слика С5 приказује ове графиконе, који су обојени како мутације утичу на АЦЕ2 афинитет или експресију РБД.(Ц) Кинетика РБД мутације код пацијената лечених РЕГН-ЦОВ2 145. дана инфекције (црна тачкаста вертикална линија).Учесталост повезивања између Е484А и Ф486И се повећала, али пошто Е484А није мутација у бекству на нашој слици, није приказана на другим панелима.Види такође слику.С4.(Д) Есцапе мутације које се јављају у ћелијској култури и инфицираним пацијентима су доступне помоћу једног нуклеотида, а везивање есцапе антитела не узрокује никакве веће трошкове за АЦЕ2 афинитет [како се мери методом приказа квасца (7)).Свака тачка је мутација, а њен облик и боја указују на то да ли јој се може приступити и одабрати током раста вируса.Више тачака на десној страни на к-оси указује на јаче ослобађање антитела;више тачке на и-оси указују на већи АЦЕ2 афинитет.
Да бисмо утврдили да ли Есцапе Атлас може да анализира еволуцију вируса који инфицирају људе, испитали смо податке дубоког секвенцирања од трајно зараженог имунокомпромитованог пацијента који је примио РЕГН-ЦОВ2 145. дана након дијагнозе лечења ЦОВИД-19 (16).Касно лечење омогућава пацијентовој вирусној популацији да акумулира генетски диверзитет, од којих неки могу бити вођени имунолошким стресом, јер пацијент има слаб одговор аутонеутрализујућих антитела пре лечења (16).Након примене РЕГН-ЦОВ2, учесталост пет мутација амино киселина у РБД се брзо променила (Слика 2Ц и Слика С4).Наша мапа бекства показала је да су три од ових мутација побегле од РЕГН10933, а једна од РЕГН10987 (слика 2Б).Вреди напоменути да након третмана антителима нису све мутације пренете на фиксно место.Напротив, постоји пораст и пад конкуренције (Слика 2Ц).Овај образац је примећен у унутрашњој еволуцији адаптивних домаћина других вируса (17, 18), вероватно због конкуренције између генетских слободних и вирусних линија.Чини се да обе ове силе играју улогу код пацијената са упорном инфекцијом (слика 2Ц и слика С4Ц): Е484А (није мутација за бекство у нашем дијаграму) и Ф486И (избегавање РЕГН10933) који се слободно возе након третмана, и вирусне линије које носе Н440Д и К493К (који је побегао од РЕГН10987 и РЕГН10933, респективно) се прво такмичио са бежачким мутантом РЕГН10933 И489Х, а затим се такмичио са лозом која је носила Е484А и Ф486И и К493К.
Три од четири мутације бекства код пацијената лечених РЕГН-ЦОВ2 нису идентификоване у Регенероновој селекцији ћелијске културе вируса (Слика 2Б), што илуструје предност комплетне мапе.Селекција вируса је непотпуна јер могу да идентификују само све мутације које су насумично одабране у том експерименту са ћелијском културом.Напротив, комплетна мапа означава све мутације, које могу укључивати мутације узроковане разлозима који нису повезани са лечењем, али случајно утичу на везивање антитела.
Наравно, на еволуцију вируса утичу функционална ограничења и притисак да се избегну антитела.Мутације и пацијенти одабрани у ћелијској култури увек испуњавају следеће критеријуме: избегавају везивање антитела, могу да уђу кроз једну промену нуклеотида и имају малу или никакву цену за АЦЕ2 афинитет [преко претходних дубоких мутација приказаних коришћењем мерења скенирања квасца РБД (7 )] (Слика 2Д и Слика С5).Стога, комплетна мапа како мутације утичу на кључне биохемијске фенотипове РБД-а (као што су АЦЕ и везивање антитела) може се користити за процену могућих путева за еволуцију вируса.Једно упозорење је да у дужем еволуционом временском оквиру, као што је примећено код вирусног имунитета и бекства лека, због епистатичких интеракција, простор толеранције за мутације може да се промени (19-21).
Комплетна мапа нам омогућава да проценимо постојеће мутације за бекство у циркулишућем САРС-ЦоВ-2.Проверили смо све доступне секвенце САРС-ЦоВ-2 добијене од људи од 11. јануара 2021. и открили да је велики број РБД мутација избегао једно или више антитела (Слика 3).Међутим, једина есцапе мутација присутна у >0,1% секвенце је РЕГН10933 есцапе мутант И453Ф [0,3% секвенце;видети (12)], РЕГН10987 есцапе мутант Н439К [1,7% секвенце;видети Слику 1Ц и (22)], и ЛИ-ЦоВ016 есцапе мутација К417Н (0,1% секвенца; видети такође Слику 1Ц).И453Ф је повезан са независним епидемијама у вези са фармама минка у Холандији и Данској (23, 24);вреди напоменути да сама минк секвенца понекад садржи и друге мутације за бекство, као што је Ф486Л (24).Н439К је веома популаран у Европи и чини велики део низа из Шкотске и Ирске у Европи (22, 25).К417Н постоји у линији Б.1.351 која је први пут откривена у Јужној Африци (10).Још једна мутација која тренутно изазива забринутост је Н501И, која је присутна у Б.1.351 и такође у лози Б.1.1.7 првобитно идентификованој у УК (9).Наша мапа показује да Н501И нема ефекта на РЕГН-ЦОВ2 антитело, али само умерено утиче на ЛИ-ЦоВ016 (Слика 3).
За свако антитело или комбинацију антитела, од 11. јануара 2021. године, међу 317.866 висококвалитетних секвенци САРС-ЦоВ-2 добијених од људи на ГИСАИД-у (26), однос између резултата евакуације за сваку мутацију и њене учесталости.Означено је.РЕГН-ЦОВ2 коктел мутација Е406В захтева вишеструке промене нуклеотида у Вухан-Ху-1 РБД секвенци, и није примећена у ГИСАИД секвенци.Друге мутације остатка Е406 (Е406К и Е406Д) примећене су са бројањем ниске фреквенције, али ове мутантне аминокиселине нису мутације појединачних нуклеотида далеко од В.
Као што се и очекивало, есцапе мутације се обично јављају у интерфејсу антитело-РБД.Међутим, сама структура није довољна да се предвиди које мутације посредују у бекству.На пример, ЛИ-ЦоВ016 користи своје тешке и лаке ланце да се веже за широк епитоп који се преклапа са површином везивања АЦЕ2, али процес бекства укључује мутације у РБД остацима у региону који одређује комплементарност тешког ланца (слика 4А и слика С6, Е до Г).Насупрот томе, бекства од РЕГН10933 и РЕГН10987 углавном су се десила на остацима РБД који су наслагани на интерфејсу тешких и лаких ланаца антитела (Слика 4А и Слика С6, А до Д).Мутација Е406В која је избегла мешавину РЕГН-ЦОВ2 десила се на остацима који нису били у контакту ни са једним антителом (Слика 4, А и Б).Иако је Е406 структурно ближи ЛИ-ЦоВ016 (слика 4Б и слика С6Х), мутација Е406В има много мањи ефекат на антитело (слика 1, Б и Ц), што указује да је специфични структурни механизам дугог домета анти-РЕГН - ЦОВ2 антитело (слика С6И).Укратко, мутације на остацима РБД у контакту са антителима не посредују увек у бекству, а неке значајне мутације за бекство се јављају на остацима који нису у контакту са антителима (слика 4Б и слика С6, Д и Г).
(А) Есцапе дијаграм пројектован на РБД структуру везану антителом.[РЕГН10933 и РЕГН10987: База података о протеинима (ПДБ) ИД 6КСДГ (11);ЛИ-ЦоВ016: ПДБ ИД 7Ц01 (13)].Варијабилни домени тешких и лаких ланаца антитела су приказани као плави цртани филмови, а боја на површини РБД-а указује на снагу бекства посредованог мутацијом на овом месту (бела означава да нема бекства, а црвена означава најјаче место бекства антитела или смеше).Сајтови који нису функционално мутирани су засивљени.(Б) За свако антитело, класификујте место као директан контакт са антителом (не-водонички атоми унутар 4А од антитела), проксимално антитело (4 до 8А) или дистално антитело (> 8А).Свака тачка представља локацију, подељену на бекство (црвено) или не-бежање (црно).Сива испрекидана линија представља критичну вредност која се користи за класификовање сајта као евакуативног или неуспешног (за детаље погледајте Материјали и методе).Црвени и црни бројеви означавају колико локација у свакој категорији је уклоњено или неоткривено.
У овој студији смо у потпуности мапирали мутације које избегавају три главна анти-САРС-ЦоВ-2 антитела.Ове мапе указују да је претходна карактеризација мутација бекства непотпуна.Нису идентификоване ни мутације појединачних аминокиселина које могу да избегну два антитела у РЕГН-ЦОВ2 коктелу, нити су идентификовали већину пацијената са упорном инфекцијом лечених коктелом.мутација.Наравно, наша мапа још није одговорила на најхитније питање: да ли ће САРС-ЦоВ-2 развити широку отпорност на ова антитела?Али оно што је извесно је да је забрињавајуће да толико мутација за бекство има мали утицај на савијање РБД или афинитет рецептора, а већ постоје неке мутације ниског нивоа у циркулишућим вирусима.На крају, потребно је сачекати и посматрати које ће мутације САРС-ЦоВ-2 пренети када се прошири међу становништвом.Наш рад ће помоћи „посматрању“ тако што ћемо одмах објаснити утицај мутација класификованих надзором вирусног генома.
Ово је чланак отвореног приступа који се дистрибуира под условима лиценце Цреативе Цоммонс Аттрибутион.Чланак дозвољава неограничену употребу, дистрибуцију и репродукцију у било ком медију под условом да је оригинално дело правилно цитирано.
Напомена: Од вас тражимо само да наведете своју адресу е-поште како би особа коју препоручите на страници знала да желите да види е-пошту и да није нежељена пошта.Нећемо ухватити ниједну адресу е-поште.
Ово питање се користи за тестирање да ли сте посетилац и спречавање аутоматског слања нежељене поште.
Тајлер Н. Стар, Алисон Џ. Грини, Амин Адетија, Вилијам В. Ханон, Маниш Ц. Чадхари (Маниш Ц. Чаухари), Адам С. Дингес (Адам С.
Комплетна мапа САРС-ЦоВ-2 мутација које измичу мешавини моноклонских антитела Регенерон помаже да се објасни еволуција вируса у лечењу пацијената.
Тајлер Н. Стар, Алисон Џ. Грини, Амин Адетија, Вилијам В. Ханон, Маниш Ц. Чадхари (Маниш Ц. Чаухари), Адам С. Дингес (Адам С.
Комплетна мапа САРС-ЦоВ-2 мутација које измичу мешавини моноклонских антитела Регенерон помаже да се објасни еволуција вируса у лечењу пацијената.
©2021 Америчко удружење за унапређење науке.Сва права задржана.АААС је партнер ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ЦХОРУС, ЦЛОЦКСС, ЦроссРеф и ЦОУНТЕР.Сциенце ИССН 1095-9203.
Време поста: 24. фебруар 2021