Flera antikroppar är redan i bruk eller under utveckling som terapier för behandling av covid-19.Med uppkomsten av nya varianter av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), är det viktigt att förutsäga om de fortfarande kommer att vara mottagliga för antikroppsbehandling.Starr et al.Ett jästbibliotek användes, som täcker alla mutationer i SARS-CoV-2-receptorbindningsdomänen som inte kraftigt kommer att störa bindningen till värdreceptorn (ACE2), och kartlägga hur dessa mutationer påverkar de tre huvudsakliga anti-SARS-CoV -2 antikroppsbindning.Dessa figurer identifierar mutationer som undkommer antikroppsbindning, inklusive enstaka mutationer som undkommer de två antikropparna i Regeneron-antikroppsblandningen.Många mutationer som undkommer en enda antikropp sprider sig i människor.
Antikroppar är en potentiell terapi för behandling av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), men det är inte klart att viruset utvecklas för att undkomma sin risk.Här kartlägger vi hur alla mutationer i SARS-CoV-2-receptorbindningsdomänen (RBD) påverkar bindningen av REGN-COV2-cocktailen till antikroppen LY-CoV016.Dessa kompletta kartor avslöjade en aminosyramutation som helt undvek REGN-COV2-blandningen, som är sammansatt av två antikroppar REGN10933 och REGN10987 som riktar sig mot olika strukturella epitoper.Dessa siffror identifierar också virusmutationer som selekteras i ihållande infekterade patienter som behandlats med REGN-COV2 och under in vitro-val av virusflykt.Slutligen avslöjar dessa siffror att mutationer som undkommer en enda antikropp redan finns i cirkulerande SARS-CoV-2-stammar.Dessa kompletta flyktkartor kan förklara konsekvenserna av mutationer som observerats under virusövervakning.
Antikroppar utvecklas för att behandla allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (1).Antikroppar mot vissa andra virus kan göras ineffektiva av virusmutationer som väljs ut under behandlingen av infekterade patienter (2, 3) eller virusmutationer som har spridit sig globalt för att ge resistens till hela viruskladden.Därför är det avgörande att bestämma vilka SARS-CoV-2-mutationer som kan undkomma nyckelantikroppar för att bedöma hur mutationer som observeras under virusövervakning påverkar effektiviteten av antikroppsterapi.
De flesta ledande anti-SARS-CoV-2-antikropparna riktar sig mot den virala receptorbindningsdomänen (RBD), som förmedlar bindning till den angiotensinomvandlande enzym 2 (ACE2)-receptorn (5, 6).Nyligen har vi utvecklat en djupmutationsskanningsmetod för att kartlägga hur alla mutationer av RBD påverkar dess funktion och igenkänning av antivirala antikroppar (7, 8).Metoden innebär att skapa ett bibliotek av RBD-mutanter, uttrycka dem på ytan av jäst och använda fluorescensaktiverad cellsortering och djupsekvensering för att kvantifiera hur varje mutation påverkar RBD-veckning, ACE2-affinitet (mätt i en titreringsserie) och antikroppsbindning (Figur S1A).I denna studie använde vi det repetitiva mutantbiblioteket som beskrivs i (7), som är sammansatt av streckkodade RBD-varianter, som täcker 3804 av de 3819 möjliga aminosyramutationerna.Vårt bibliotek bereddes från RBD genetiska bakgrunden av det tidiga isolatet Wuhan-Hu-1.Även om frekvensen av flera mutanter ökar, representerar de fortfarande de vanligaste RBD-sekvenserna (9, 10).Vi har ritat två av 2034 mutationer som inte starkt stör RBD-vikningen och ACE-bindningen (7) hur man skickar REGN-COV2-cocktailen (REGN10933 och REGN10987) (11, 12) och Eli Lillys LY-CoV016 Den rekombinanta formen av antikropp påverkar metoden för att binda antikropp (även kallad CB6 eller JS016) (13) (Figur S1B).REGN-COV2 beviljades nyligen ett nödtillstånd för användning av covid-19 (14), medan LY-CoV016 för närvarande genomgår kliniska fas 3-prövningar (15).
[Glu406→Trp(E406W)] undgick kraftigt blandningen av två antikroppar (Figur 1A).Flyktkartan för LY-CoV016 avslöjade också många flyktmutationer på olika platser i RBD (Figur 1B).Även om vissa flyktmutationer kan försämra förmågan hos RBD att binda till ACE2 eller uttryckas i en lämplig veckad form, enligt tidigare mätningar av djupmutationsskanning med jästvisad RBD, har många funktionella mutationer liten eller ingen effekt på dessa funktionella egenskaper (7 ) (Figur 1, A och B representerar förlusten av ACE2-affinitet, medan figur S2 representerar minskningen av RBD-uttryck.
(A) Kartläggning av antikroppen i REGN-COV2.Linjediagrammet till vänster visar flykten på varje plats i RBD (summan av alla mutationer på varje plats).Logotypen till höger visar den starka utrymningsplatsen (lila understrykning).Höjden på varje bokstav är proportionell mot styrkan av flykten som förmedlas av aminosyramutationen, och en "flyktpoäng" på 1 för varje mutation motsvarar en fullständig flykt.Skalan på y-axeln är olika för varje rad, så till exempel E406W slipper alla REGN-antikroppar, men den är mest uppenbar för cocktails eftersom den överväldigas av de andra utrymningsställena för individuella antikroppar.För den skalbara versionen används S2, A och B för att färglägga kartan efter hur mutationer påverkar uttrycket av vikt RBD.S2, C och D används för att fördela påverkan på ACE2-affinitet och RBD-uttryck bland alla mutationer som observerats i cirkulerande virusisolat.(B) Som visas i (A), rita LY-CoV016.(C) Använd spik-pseudotypade lentivirala partiklar för att verifiera nyckelmutationer i neutraliseringsanalysen.Vi valde att verifiera de mutationer som förutspås ha en större inverkan eller finns med hög frekvens i SARS-CoV-2-isolat (som N439K) i cirkulationen.Varje punkt representerar den dubbla ökningen av den medianhämmande koncentrationen (IC50) av mutationen i förhållande till toppen av den omuterade vildtypen (WT) som innehåller D614G.Den blå streckade linjen 1 representerar en neutraliseringseffekt som liknar WT, och ett värde > 1 representerar ett ökat neutraliseringsmotstånd.Färgen på punkten indikerar om du vill fly från kartan.Prickarna indikerar att eftersom IC50 är utanför den spädningsserie som används kontrolleras den multipla förändringen (övre eller undre gräns).De flesta mutanter testas i duplikat, så det finns två punkter.Den fullständiga neutraliseringskurvan visas i figur 2. S3.Enbokstavsförkortningarna av aminosyrarester är som följer: A, Ala;C, cystein;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;H, hans;I, Ile;K, lysin;L, Liu;Metropolis N, Assen;P, Pro;Q, Gin;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Val;W, tryptofan;och Y, Tyr.
För att verifiera den antigena effekten av nyckelmutationer utförde vi en neutraliseringsanalys med panikelpseudotypade lentivirala partiklar och fann att det fanns en överensstämmelse mellan antikroppsbindande flyktkartan och neutraliseringsanalysen (Figur 1C och Figur S3).Som förväntat av REGN-COV2-antikroppskartan neutraliseras mutationen vid position 486 endast av REGN10933, medan mutationen vid positionerna 439 och 444 endast neutraliseras av REGN10987, så dessa mutationer kan inte undkomma.Men E406W undgick de två REGN-COV2-antikropparna, så den klarade sig också kraftigt från blandningen.Genom strukturanalys och urval av virusflykt tror Regeneron att ingen enskild aminosyramutation kan undkomma de två antikropparna i cocktailen (11, 12), men vår fullständiga karta identifierar E406W som en cocktailflyktsmutation.E406W påverkar REGN-COV2-antikroppen på ett relativt specifikt sätt och stör inte allvarligt funktionen av RBD, eftersom det endast något minskar neutraliseringseffekten av LY-CoV016 (Figur 1C) och titern för spetsade pseudotypade lentivirala partiklar (Figur S3F).
För att undersöka om vår flyktkarta överensstämmer med utvecklingen av virus under antikroppsselektion, kontrollerade vi först data från Regeneron virus escape selektionsexperimentet, där expressionspiken odlades i cellkultur i närvaro av någon REGN10933 vesikulär stomatitvirus (VSV), REGN10987 eller REGN-COV2 cocktail (12).Detta arbete identifierade fem flyktmutationer från REGN10933, två flyktmutationer från REGN10987 och inga mutationer från cocktail (Figur 2A).Mutationerna som väljs av alla sju cellkulturer är markerade i vår flyktkarta, och enkelnukleotidförändringen av vildtypskodonet i Wuhan-Hu-1 RBD-sekvensen är också tillgänglig (Figur 2B), vilket indikerar skillnaden mellan flyktkonkordans graf och virusutveckling under antikroppstryck i cellkultur.Det är värt att notera att E406W inte kan nås med enstaka nukleotidförändringar, vilket kan förklara varför Regeneron-cocktailvalet inte kan identifiera det trots den relativt goda toleransen för RBD-vikning och ACE2-affinitet.
(A) I närvaro av antikroppar använder Regeneron panikelpseudotyp VSV för att välja ut virusutrymningsmutationer i cellkultur (12).(B) Flyktdiagrammet, som visas i figur 1A, men visar endast de mutationer som är tillgängliga genom en enda nukleotidförändring i Wuhan-Hu-1-sekvensen.Icke-grå indikerar mutationer i cellkultur (röd) och infekterade patienter (blå) ), eller båda (lila).Figur S5 visar dessa grafer, som är färgade av hur mutationer påverkar ACE2-affinitet eller RBD-uttryck.(C) Kinetik för RBD-mutation hos patienter som behandlades med REGN-COV2 på den 145:e infektionsdagen (svart prickad vertikal linje).Frekvensen av koppling mellan E484A och F486I ökade, men eftersom E484A inte är en flyktmutation i vår figur visas den inte i andra paneler.Se även figur.S4.(D) De flyktmutationer som uppstår i cellodling och infekterade patienter är tillgängliga med en enda nukleotid, och bindningen av flyktantikroppar orsakar ingen större kostnad för ACE2-affinitet [uppmätt med jästvisningsmetoden (7)].Varje punkt är en mutation, och dess form och färg indikerar om den kan nås och väljas under virustillväxt.De mer högra punkterna på x-axeln indikerar starkare antikroppsbindningsflykt;de högre punkterna på y-axeln indikerar högre ACE2-affinitet.
För att avgöra om Escape Atlas kan analysera utvecklingen av virus som infekterar människor, undersökte vi djupsekvenseringsdata från en ihållande infekterad immunförsvagad patient som fick REGN-COV2 den 145:e dagen efter diagnosen COVID-19-behandling (16).Sen behandling gör att patientens viruspopulation kan ackumulera genetisk mångfald, varav en del kan drivas av immunstress, eftersom patienten har ett svagt autoneutraliserande antikroppssvar före behandling (16).Efter administrering av REGN-COV2 förändrades frekvensen av fem aminosyramutationer i RBD snabbt (Figur 2C och Figur S4).Vår flyktkarta visade att tre av dessa mutationer undkom REGN10933 och en undkom REGN10987 (Figur 2B).Det är värt att notera att efter antikroppsbehandlingen överfördes inte alla mutationer till det fixerade stället.Tvärtom finns konkurrensens uppgång och fall (Figur 2C).Detta mönster har observerats i den interna utvecklingen av de adaptiva värdarna för andra virus (17, 18), möjligen på grund av konkurrens mellan genetisk friåkning och virala linjer.Båda dessa krafter tycks spela en roll för patienter med ihållande infektion (Figur 2C och Figur S4C): E484A (inte en flyktmutation i vårt diagram) och F486I (Escape REGN10933) friåkning efter behandling, och viruslinjer som bär N440D och Q493K (flyktande REGN10987 respektive REGN10933) tävlade först med REGN10933 escape-mutanten Y489H och tävlade sedan med linjen som bar E484A och F486I och Q493K.
Tre av de fyra flyktmutationerna hos patienter som behandlats med REGN-COV2 identifierades inte i Regenerons viruscellkulturselektion (Figur 2B), vilket illustrerar fördelen med den kompletta kartan.Virusurvalet är ofullständigt eftersom de bara kan identifiera eventuella mutationer som valts slumpmässigt i det specifika cellodlingsexperimentet.Tvärtom, den fullständiga kartan annoterar alla mutationer, vilket kan inkludera mutationer orsakade av orsaker som inte är relaterade till behandlingen, men som av misstag påverkar antikroppsbindningen.
Naturligtvis påverkas utvecklingen av virus av funktionella begränsningar och tryck att undvika antikroppar.Mutationerna och patienterna som väljs ut i cellkultur uppfyller alltid följande kriterier: de slipper antikroppsbindning, kan komma in genom en enda nukleotidförändring och har liten eller ingen kostnad för ACE2-affinitet [genom de tidigare djupa mutationerna som visades med jästskanningsmätning RBD (7 )] (Figur 2D och Figur S5).Därför kan en komplett karta över hur mutationer påverkar viktiga biokemiska fenotyper av RBD (som ACE och antikroppsbindning) användas för att bedöma möjliga vägar för virusutveckling.En varning är att inom en längre evolutionär tidsram, som observerats vid viral immunitet och läkemedelsflykt, på grund av epistatiska interaktioner, kan toleransutrymmet för mutationer förändras (19-21).
Den kompletta kartan låter oss utvärdera de befintliga flyktmutationerna i den cirkulerande SARS-CoV-2.Vi kontrollerade alla tillgängliga human-härledda SARS-CoV-2-sekvenser den 11 januari 2021 och fann att ett stort antal RBD-mutationer undgick en eller flera antikroppar (Figur 3).Emellertid är den enda flyktmutationen närvarande i >0,1 % av sekvensen REGN10933 escape-mutanten Y453F [0,3 % av sekvensen;se (12)], REGN10987 undkomma mutant N439K [1,7% av sekvensen;se figur 1C och (22)], och LY-CoV016 undkomma mutation K417N (0,1 % sekvens; se även figur 1C).Y453F är förknippat med oberoende utbrott relaterade till minkfarmer i Nederländerna och Danmark (23, 24);det är värt att notera att minksekvensen i sig ibland innehåller andra flyktmutationer, såsom F486L (24).N439K är mycket populär i Europa, och utgör en stor del av sekvensen från Skottland och Irland i Europa (22, 25).K417N finns i B.1.351-linjen som först upptäcktes i Sydafrika (10).En annan mutation av aktuellt intresse är N501Y, som finns i B.1.351 och även i B.1.1.7-linjen som ursprungligen identifierades i Storbritannien (9).Vår karta visar att N501Y inte har någon effekt på REGN-COV2-antikropp, utan endast måttlig effekt på LY-CoV016 (Figur 3).
För varje antikropp eller antikroppskombination, från och med den 11 januari 2021, bland de 317 866 högkvalitativa human-härledda SARS-CoV-2-sekvenserna på GISAID (26), förhållandet mellan flyktpoängen för varje mutation och dess frekvens.Det är markerat.REGN-COV2 cocktail escape-mutationen E406W kräver flera nukleotidförändringar i Wuhan-Hu-1 RBD-sekvensen och observeras inte i GISAID-sekvensen.Andra mutationer av rest E406 (E406Q och E406D) observerades med lågfrekvensräkning, men dessa muterade aminosyror är inte enstaka nukleotidmutationer långt borta från W.
Som förväntat förekommer flyktmutationer vanligtvis i antikropp-RBD-gränssnittet.Enbart struktur räcker dock inte för att förutsäga vilka mutationer som förmedlar flykt.Till exempel använder LY-CoV016 sina tunga och lätta kedjor för att binda till en bred epitop som överlappar ACE2-bindningsytan, men flyktprocessen involverar mutationer i RBD-rester i den tungkedjekomplementaritetsbestämmande regionen (Figur 4A och Figur S6, E till G).Däremot inträffade rymningar från REGN10933 och REGN10987 huvudsakligen vid RBD-rester staplade vid gränsytan mellan antikroppars tunga och lätta kedjor (Figur 4A och Figur S6, A till D).E406W-mutationen som undgick REGN-COV2-blandningen inträffade vid rester som inte var i kontakt med någon av antikropparna (Figur 4, A och B).Även om E406 är strukturellt närmare LY-CoV016 (Figur 4B och Figur S6H), har E406W-mutationen en mycket mindre effekt på antikroppen (Figur 1, B och C), vilket indikerar att den specifika långväga strukturella mekanismen är anti-REGN - COV2-antikropp (Figur S6I).Sammanfattningsvis förmedlar mutationer vid RBD-rester i kontakt med antikroppar inte alltid flykt, och vissa betydande flyktmutationer förekommer vid rester som inte är i kontakt med antikroppar (Figur 4B och Figur S6, D och G).
(A) Flyktdiagrammet projiceras på RBD-strukturen bunden av antikroppen.[REGN10933 och REGN10987: Protein Database (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].De variabla domänerna i antikroppens tunga och lätta kedjor visas som blå tecknade serier, och färgen på ytan av RBD indikerar styrkan av den mutationsmedierade flykten på denna plats (vit anger ingen flykt, och röd anger den starkaste flyktstället för antikroppen eller blandningen).Webbplatser som inte är funktionellt muterade är nedtonade.(B) För varje antikropp, klassificera platsen som direkt antikroppskontakt (icke-väteatomer inom 4Å från antikroppen), proximal antikropp (4 till 8Å) eller distal antikropp (> 8Å).Varje punkt representerar en plats, uppdelad i escape (röd) eller non-escape (svart).Den grå streckade linjen representerar det kritiska värdet som används för att klassificera platsen som flykt eller icke-flykt (för detaljer, se Material och metoder).De röda och svarta siffrorna anger hur många webbplatser i varje kategori som är escaped eller unescaped.
I denna studie har vi helt kartlagt mutationerna som undviker de tre stora anti-SARS-CoV-2-antikropparna.Dessa kartor indikerar att den tidigare karakteriseringen av flyktmutationer är ofullständig.Varken enskilda aminosyramutationer som kan undkomma de två antikropparna i REGN-COV2-cocktailen har identifierats, och de har inte heller identifierat majoriteten av patienter med ihållande infektion som behandlats med cocktailen.mutation.Naturligtvis har vår karta ännu inte svarat på den mest angelägna frågan: Kommer SARS-CoV-2 att utveckla omfattande resistens mot dessa antikroppar?Men vad som är säkert är att det är oroande att så många flyktmutationer har liten effekt på RBD-veckning eller receptoraffinitet, och det finns redan några lågnivåmutationer i cirkulerande virus.I slutändan är det nödvändigt att vänta och observera vilka mutationer SARS-CoV-2 kommer att överföra när den sprider sig bland befolkningen.Vårt arbete kommer att hjälpa "observation" genom att omedelbart förklara effekterna av mutationer som klassificeras genom virusgenomövervakning.
Detta är en artikel med öppen tillgång som distribueras under villkoren i Creative Commons Attribution License.Artikeln tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst under förutsättning att originalverket är korrekt citerat.
Obs: Vi ber dig endast att ange din e-postadress så att personen du rekommenderar till sidan vet att du vill att den ska se mejlet och att det inte är spam.Vi kommer inte att fånga några e-postadresser.
Denna fråga används för att testa om du är en besökare och förhindra automatisk skräppost.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Den kompletta kartan över SARS-CoV-2-mutationer som undkommer från Regeneron monoklonala antikroppsblandningar hjälper till att förklara utvecklingen av viruset vid behandling av patienter.
Tyler N.Starr, Allison J.Greaney, Amin Addetia, William W. Hannon, Manish C. Choudhary (Manish C. Choudhary), Adam S. Dinges (Adam S.
Den kompletta kartan över SARS-CoV-2-mutationer som undkommer från Regeneron monoklonala antikroppsblandningar hjälper till att förklara utvecklingen av viruset vid behandling av patienter.
©2021 American Association for the Advancement of Science.Alla rättigheter förbehållna.AAAS är partner till HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef och COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Posttid: 24 februari 2021