Кілька антитіл уже використовуються або розробляються як терапія для лікування COVID-19.З появою нових варіантів важкого гострого респіраторного синдрому коронавірусу 2 (SARS-CoV-2) важливо передбачити, чи будуть вони все ще чутливі до терапії антитілами.Старр та ін.Було використано дріжджову бібліотеку, яка охоплює всі мутації в домені зв’язування рецептора SARS-CoV-2, які не сильно порушують зв’язування з рецептором хазяїна (ACE2), і відобразила, як ці мутації впливають на три основні анти-SARS-CoV. -2 зв'язування антитіл.Ці цифри ідентифікують мутації, які уникають зв’язування антитіл, включаючи окремі мутації, які уникають двох антитіл у суміші антитіл Regeneron.Багато мутацій, які вислизають від одного антитіла, поширюються серед людей.
Антитіла є потенційною терапією для лікування важкого гострого респіраторного синдрому коронавірусу 2 (SARS-CoV-2), але неясно, чи розвивається вірус, щоб уникнути їх ризику.Тут ми показуємо, як усі мутації в домені зв’язування рецептора SARS-CoV-2 (RBD) впливають на зв’язування коктейлю REGN-COV2 з антитілом LY-CoV016.Ці повні карти виявили амінокислотну мутацію, яка повністю уникла суміші REGN-COV2, яка складається з двох антитіл REGN10933 і REGN10987, націлених на різні структурні епітопи.Ці цифри також ідентифікують мутації вірусу, відібрані у постійно інфікованих пацієнтів, які отримували REGN-COV2, і під час селекції вірусу in vitro.Нарешті, ці цифри показують, що мутації, які вислизають від одного антитіла, вже присутні в циркулюючих штамах SARS-CoV-2.Ці повні карти втечі можуть пояснити наслідки мутацій, які спостерігаються під час спостереження за вірусами.
Розробляються антитіла для лікування важкого гострого респіраторного синдрому, викликаного коронавірусом 2 (SARS-CoV-2) (1).Антитіла проти деяких інших вірусів можуть бути неефективними через вірусні мутації, відібрані під час лікування інфікованих пацієнтів (2, 3), або вірусні мутації, які поширилися по всьому світу, щоб надати стійкість усьому вірусному класу.Таким чином, визначення того, які мутації SARS-CoV-2 можуть уникнути ключових антитіл, має вирішальне значення для оцінки того, як мутації, які спостерігаються під час спостереження за вірусами, впливають на ефективність терапії антитілами.
Більшість провідних антитіл проти SARS-CoV-2 націлені на домен зв’язування вірусного рецептора (RBD), який опосередковує зв’язування з рецептором ангіотензинперетворювального ферменту 2 (ACE2) (5, 6).Нещодавно ми розробили метод глибокого сканування мутацій, щоб відобразити, як усі мутації RBD впливають на його функцію та розпізнавання антивірусними антитілами (7, 8).Метод передбачає створення бібліотеки мутантів RBD, їх експресію на поверхні дріжджів і використання активованого флуоресценцією сортування клітин і глибокого секвенування для кількісного визначення того, як кожна мутація впливає на згортання RBD, афінність ACE2 (вимірюється в серії титрування) і зв’язування антитіл. (Малюнок S1A).У цьому дослідженні ми використовували бібліотеку повторюваних мутантів, описану в (7), яка складається з варіантів RBD зі штрих-кодом, що охоплює 3804 з 3819 можливих мутацій амінокислот.Наша бібліотека була підготовлена з генетичного фону RBD раннього ізоляту Wuhan-Hu-1.Хоча частота кількох мутантів зростає, вони все ще представляють найпоширеніші послідовності RBD (9, 10).Ми намалювали дві з 2034 мутацій, які не сильно порушують згортання RBD і зв’язування ACE (7), як передавати коктейль REGN-COV2 (REGN10933 і REGN10987) (11, 12) і LY-CoV016 Елі Ліллі. Рекомбінантна форма антитіло впливає на спосіб зв’язування антитіла (також називається CB6 або JS016) (13) (Малюнок S1B).REGN-COV2 нещодавно отримав екстрений дозвіл на використання для COVID-19 (14), тоді як LY-CoV016 зараз проходить фазу 3 клінічних випробувань (15).
[Glu406→Trp(E406W)] сильно уникнув суміші двох антитіл (рис. 1A).Карта втечі LY-CoV016 також виявила багато мутацій втечі в різних місцях RBD (рис. 1B).Незважаючи на те, що деякі висхідні мутації можуть погіршити здатність RBD зв’язуватися з ACE2 або експресуватись у відповідній складеній формі, згідно з попередніми вимірюваннями сканування глибоких мутацій із використанням RBD, що демонструється дріжджами, багато функціональних мутацій мають незначний або зовсім не впливають на ці функціональні властивості (7). ) (Рис. 1, A і B представляють втрату спорідненості ACE2, тоді як рис. S2 демонструє зниження експресії RBD.
(A) Картування антитіла в REGN-COV2.Лінійний графік ліворуч показує вихід на кожній ділянці в RBD (сума всіх мутацій на кожній ділянці).Зображення логотипу праворуч показує сильну точку втечі (фіолетове підкреслення).Висота кожної літери пропорційна силі виходу, опосередкованого мутацією амінокислоти, і «оцінка виходу» 1 для кожної мутації відповідає повному виходу.Шкала осі Y відрізняється для кожного рядка, тому, наприклад, E406W усуває всі антитіла REGN, але це найбільш очевидно для коктейлів, оскільки він переповнений іншими місцями виходу окремих антитіл.У масштабованій версії S2, A і B використовуються для фарбування карти залежно від того, як мутації впливають на експресію згорнутого RBD.S2, C і D використовуються для розподілу впливу на афінність ACE2 і експресію RBD серед усіх мутацій, що спостерігаються в циркулюючих ізолятах вірусу.(B) Як показано на (A), намалюйте LY-CoV016.(C) Використовуйте спайк-псевдотиповані лентивірусні частинки, щоб перевірити ключові мутації в аналізі нейтралізації.Ми вирішили перевірити мутації, які, за прогнозами, матимуть більший вплив або існують із високою частотою в ізолятах SARS-CoV-2 (таких як N439K) у кровообігу.Кожна точка являє собою кратне збільшення середньої інгібуючої концентрації (IC50) мутації відносно піку немутованого дикого типу (WT), що містить D614G.Синя пунктирна лінія 1 представляє ефект нейтралізації, подібний до WT, а значення> 1 означає підвищений опір нейтралізації.Колір крапки вказує на те, чи хочете ви втекти з карти.Точки вказують на те, що оскільки IC50 знаходиться за межами використаної серії розведень, перевіряється багаторазова зміна (верхня або нижня межа).Більшість мутантів перевіряють у двох примірниках, тому є два моменти.Повна крива нейтралізації показана на малюнку 2. S3.Однолітерні скорочення амінокислотних залишків такі: А, Ala;C, цистеїн;D, Asp;E, Glu;F, Phe;G, Gly;Н, його;Я, Іль;K, лізин;Л, Лю;Метрополіс N, Ассен;P, Pro;Q, Gln;R, Arg;S, Ser;T, Thr;V, Вал;W, триптофан;і Y, Tyr.
Щоб перевірити антигенний ефект ключових мутацій, ми провели аналіз нейтралізації з використанням псевдотипованих лентивірусних частинок волоті та виявили узгодженість між картою виходу зв’язування антитіла та аналізом нейтралізації (Рис. 1C і Рис. S3).Як і очікувалося з карти антитіл REGN-COV2, мутація в положенні 486 нейтралізується лише REGN10933, тоді як мутація в позиціях 439 і 444 нейтралізується лише REGN10987, тому ці мутації не можуть уникнути.Але E406W уникнув двох антитіл REGN-COV2, тому він також сильно уникнув суміші.Завдяки структурному аналізу та відбору вірусів, Regeneron вважає, що жодна окрема амінокислотна мутація не може уникнути двох антитіл у коктейлі (11, 12), але наша повна карта визначає E406W як мутацію, що дозволяє уникнути коктейлю.E406W відносно специфічно впливає на антитіло REGN-COV2 і не впливає серйозно на функцію RBD, тому що він лише незначно знижує ефект нейтралізації LY-CoV016 (рис. 1C) і титр псевдотипованих лентивірусних частинок із шипами ( рис. S3F).
Для того, щоб дослідити, чи узгоджується наша карта виходу з еволюції вірусів під час відбору антитіл, ми спочатку перевірили дані експерименту відбору втечі вірусу Regeneron, у якому сплеск експресії вирощували в культурі клітин у присутності будь-якого везикулярного REGN10933. вірус стоматиту (VSV), REGN10987 або коктейль REGN-COV2 (12).Ця робота ідентифікувала п’ять мутацій виходу з REGN10933, дві мутації виходу з REGN10987 і жодної мутації з коктейлю (рис. 2A).Мутації, відібрані всіма сімома клітинними культурами, виділені на нашій карті виходу, а також доступна однонуклеотидна зміна кодону дикого типу в послідовності Wuhan-Hu-1 RBD (рис. 2B), що вказує на різницю між виходами. графік і еволюція вірусу під тиском антитіл у культурі клітин.Варто зазначити, що до E406W неможливо отримати доступ за допомогою окремих нуклеотидних змін, що може пояснити, чому вибір коктейлю Regeneron не може ідентифікувати його, незважаючи на відносно добру переносимість згортання RBD і спорідненість з ACE2.
(A) У присутності антитіл Regeneron використовує псевдотип волоті VSV для відбору мутацій, що виключають вірус, у культурі клітин (12).(B) Діаграма виходу, як показано на малюнку 1A, але показує лише мутації, доступні шляхом зміни одного нуклеотиду в послідовності Wuhan-Hu-1.Не сірий колір означає мутації в клітинній культурі (червоний) та інфікованих пацієнтів (синій) або обидва (фіолетовий).На малюнку S5 показано ці графіки, які забарвлені залежно від того, як мутації впливають на афінність ACE2 або експресію RBD.(C) Кінетика мутації RBD у пацієнтів, які отримували REGN-COV2 на 145-й день інфекції (чорна пунктирна вертикальна лінія).Частота зв’язку між E484A та F486I зросла, але оскільки E484A не є вихідною мутацією на нашому малюнку, вона не показана на інших панелях.Дивіться також малюнок.S4.(D) Вихідні мутації, які виникають у клітинній культурі та інфікованих пацієнтів, доступні за допомогою одного нуклеотиду, і зв’язування висхідних антитіл не спричиняє жодних значних витрат на афінність ACE2 [як вимірюється методом дріжджового відображення (7)].Кожна точка є мутацією, а її форма та колір вказують на те, чи можна отримати доступ до неї та вибрати її під час росту вірусу.Більша кількість правих точок на осі абсциссів вказує на сильніше зв’язування антитіл;більш високі точки на осі y вказують на вищу спорідненість ACE2.
Щоб визначити, чи може Escape Atlas аналізувати еволюцію вірусів, що інфікують людей, ми дослідили дані глибокого секвенування від постійно інфікованого пацієнта з ослабленим імунітетом, який отримав REGN-COV2 на 145-й день після діагностики лікування COVID-19 (16).Пізнє лікування дозволяє вірусній популяції пацієнта накопичувати генетичне різноманіття, деяке з якого може бути викликано імунним стресом, оскільки пацієнт має слабку відповідь аутонейтралізуючих антитіл до лікування (16).Після введення REGN-COV2 частота п’яти амінокислотних мутацій у RBD швидко змінилася (рис. 2C і рис. S4).Наша карта втечі показала, що три з цих мутацій уникли REGN10933, а одна – REGN10987 (рис. 2B).Варто зазначити, що після обробки антитілами не всі мутації були перенесені на фіксований сайт.Навпаки, спостерігається зростання та падіння конкуренції (рис. 2C).Ця закономірність спостерігалася у внутрішній еволюції адаптивних хазяїв інших вірусів (17, 18), можливо, внаслідок конкуренції між генетичними бездіяльними та вірусними лініями.Обидві ці сили, здається, відіграють певну роль у пацієнтів із стійкою інфекцією (Малюнок 2C і Малюнок S4C): E484A (не евакуаційна мутація на нашій діаграмі) і F486I (вихідний REGN10933), що вільні після лікування, а також лінії вірусів, що несуть N440D І Q493K (відповідно від REGN10987 і REGN10933) спочатку конкурував з мутантом-втечею REGN10933 Y489H, а потім конкурував з лінією, що несе E484A, F486I і Q493K.
Три з чотирьох мутацій утечі у пацієнтів, які отримували REGN-COV2, не були ідентифіковані у відборі культури клітин вірусу Regeneron (рис. 2B), що ілюструє перевагу повної карти.Відбір вірусів є неповним, оскільки вони можуть лише ідентифікувати будь-які мутації, випадково вибрані в цьому конкретному експерименті з культурою клітин.Навпаки, повна карта коментує всі мутації, які можуть включати мутації, спричинені причинами, не пов’язаними з лікуванням, але випадково впливають на зв’язування антитіл.
Звичайно, на еволюцію вірусів впливають функціональні обмеження та тиск, спрямований на уникнення антитіл.Мутації та пацієнти, відібрані в клітинній культурі, завжди відповідають таким критеріям: вони уникають зв’язування антитіл, можуть потрапити через зміну одного нуклеотиду та мають незначні або зовсім відсутні витрати на спорідненість з ACE2 [через попередні глибокі мутації, відображені за допомогою дріжджового скануючого вимірювання RBD (7) )] (Малюнок 2D і Малюнок S5).Таким чином, для оцінки можливих шляхів еволюції вірусу можна використовувати повну карту того, як мутації впливають на ключові біохімічні фенотипи RBD (такі як АПФ і зв’язування антитіл).Одне застереження полягає в тому, що в більш тривалий час еволюції, як це спостерігається у вірусному імунітеті та втечі ліків, через епістатичні взаємодії простір толерантності до мутацій може змінитися (19-21).
Повна карта дозволяє нам оцінити існуючі евакуаційні мутації в циркулюючому SARS-CoV-2.Ми перевірили всі доступні людські послідовності SARS-CoV-2 станом на 11 січня 2021 року та виявили, що велика кількість мутацій RBD не пройшла через одне або кілька антитіл (рис. 3).Однак єдиною мутацією виходу, присутньою в >0,1% послідовності, є мутант виходу REGN10933 Y453F [0,3% послідовності;див. (12)], евакуаційний мутант REGN10987 N439K [1,7% послідовності;див. малюнок 1C і (22)], і LY-CoV016 мутація виходу K417N (0,1% послідовності; див. також малюнок 1C).Y453F пов’язаний з окремими спалахами, пов’язаними з норковими фермами в Нідерландах і Данії (23, 24);Варто зазначити, що сама послідовність норки іноді містить інші мутації, що витікають, такі як F486L (24).N439K дуже популярний у Європі та становить значну частину послідовності з Шотландії та Ірландії в Європі (22, 25).K417N існує в лінії B.1.351, вперше виявленій у Південній Африці (10).Ще одна мутація, яка зараз викликає занепокоєння, — N501Y, яка присутня в B.1.351, а також у лінії B.1.1.7, спочатку ідентифікованій у Великобританії (9).Наша карта показує, що N501Y не впливає на антитіло REGN-COV2, але лише помірно впливає на LY-CoV016 (рис. 3).
Для кожного антитіла або комбінації антитіл, станом на 11 січня 2021 року, серед 317 866 високоякісних послідовностей SARS-CoV-2, отриманих від людини на GISAID (26), зв’язок між показником виходу для кожної мутації та її частотою.Це позначено.Вихідна мутація REGN-COV2 E406W потребує численних змін нуклеотидів у послідовності Wuhan-Hu-1 RBD і не спостерігається в послідовності GISAID.Інші мутації залишку E406 (E406Q і E406D) спостерігалися при низькочастотному підрахунку, але ці мутантні амінокислоти не є одиночними нуклеотидними мутаціями далеко від W.
Як і очікувалося, вихідні мутації зазвичай відбуваються в інтерфейсі антитіло-RBD.Однак однієї лише структури недостатньо, щоб передбачити, які мутації опосередковують втечу.Наприклад, LY-CoV016 використовує свої важкі та легкі ланцюги для зв’язування з широким епітопом, який перекриває поверхню зв’язування ACE2, але процес виходу включає мутації в залишках RBD в області визначення комплементарності важкого ланцюга (Малюнок 4A та Малюнок S6, E до G).Навпаки, вихід REGN10933 і REGN10987 в основному відбувався в залишках RBD, складених на межі розділу важких і легких ланцюгів антитіла (Малюнок 4A і Малюнок S6, від A до D).Мутація E406W, яка виникла в суміші REGN-COV2, виникла в залишках, які не контактували з жодним антитілом (рис. 4, A і B).Незважаючи на те, що E406 структурно ближче до LY-CoV016 (рис. 4B і рис. S6H), мутація E406W має набагато менший вплив на антитіло (рис. 1, B і C), що вказує на те, що специфічним структурним механізмом дальньої дії є анти-REGN - антитіло до COV2 (рис. S6I).Підсумовуючи, мутації в залишках RBD, що контактують з антитілами, не завжди є посередником утечі, і деякі значні мутації втечі відбуваються в залишках, які не контактують з антитілами (Рис. 4B і Рис. S6, D і G).
(A) Діаграма виходу, спроектована на структуру RBD, зв’язану антитілом.[REGN10933 і REGN10987: білкова база даних (PDB) ID 6XDG (11);LY-CoV016: PDB ID 7C01 (13)].Варіабельні домени важкого та легкого ланцюгів антитіла показані синіми мультфільмами, а колір на поверхні RBD вказує на силу опосередкованого мутацією виходу на цьому сайті (білий означає відсутність виходу, а червоний вказує на найсильніший). місце виходу антитіла або суміші).Сайти, які функціонально не змінені, виділено сірим кольором.(B) Для кожного антитіла класифікуйте місце як прямий контакт антитіла (неводневі атоми в межах 4 Å від антитіла), проксимальне антитіло (від 4 до 8 Å) або дистальне антитіло (> 8 Å).Кожна точка представляє ділянку, розділену на втечу (червоний) і невтечу (чорний).Сіра пунктирна лінія представляє критичне значення, яке використовується для класифікації сайту як евакуаційного або невихідного (детальніше див. Матеріали та методи).Червоні та чорні числа вказують, скільки сайтів у кожній категорії є екранованими або неекранованими.
У цьому дослідженні ми повністю відобразили мутації, які уникають трьох основних антитіл проти SARS-CoV-2.Ці карти вказують на те, що попередні характеристики евакуаційних мутацій є неповними.Не було виявлено ані окремих амінокислотних мутацій, які могли б уникнути двох антитіл у коктейлі REGN-COV2, ані вони не ідентифікували більшість пацієнтів із стійкою інфекцією, які отримували цей коктейль.мутація.Звичайно, наша карта ще не дала відповіді на найактуальніше питання: чи виробить SARS-CoV-2 стійкість до цих антитіл?Але те, що є певним, викликає занепокоєння те, що так багато мутацій виходу мало впливають на згортання RBD або спорідненість рецепторів, і вже є деякі мутації низького рівня в циркулюючих вірусах.Зрештою, потрібно чекати і спостерігати, які мутації передасть SARS-CoV-2, коли пошириться серед населення.Наша робота допоможе «спостереженню», негайно пояснюючи вплив мутацій, класифікованих за допомогою спостереження за вірусним геномом.
Це стаття відкритого доступу, яка розповсюджується на умовах ліцензії Creative Commons Attribution License.Стаття дозволяє необмежене використання, розповсюдження та відтворення на будь-якому носії за умови належного цитування оригінального твору.
Примітка: ми просимо вас надати свою електронну адресу лише для того, щоб особа, яку ви рекомендуєте на сторінку, знала, що ви хочете, щоб вона побачила електронний лист і що він не є спамом.Ми не будемо фіксувати жодні електронні адреси.
Це запитання використовується, щоб перевірити, чи є ви відвідувачем, і запобігти автоматичному надсиланню спаму.
Тайлер Н.Старр, Еллісон Дж.Гріні, Амін Аддетія, Вільям В. Хеннон, Маніш С. Чудгарі (Manish C. Choudhary), Адам С. Дінгес (Adam S.
Повна карта мутацій SARS-CoV-2, які вислизають від суміші моноклональних антитіл Regeneron, допомагає пояснити еволюцію вірусу при лікуванні пацієнтів.
Тайлер Н.Старр, Еллісон Дж.Гріні, Амін Аддетія, Вільям В. Хеннон, Маніш С. Чудгарі (Manish C. Choudhary), Адам С. Дінгес (Adam S.
Повна карта мутацій SARS-CoV-2, які вислизають від суміші моноклональних антитіл Regeneron, допомагає пояснити еволюцію вірусу при лікуванні пацієнтів.
©2021 Американська асоціація сприяння розвитку науки.всі права захищені.AAAS є партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef і COUNTER.Science ISSN 1095-9203.
Час публікації: 24 лютого 2021 р