多种抗体已被使用或正在开发作为治疗 COVID-19 的疗法。随着严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 新变种的出现，预测它们是否仍然对抗体治疗敏感非常重要。斯塔尔等人。使用了酵母文库，该文库涵盖了 SARS-CoV-2 受体结合域中不会强烈破坏与宿主受体（ACE2）结合的所有突变，并绘制了这些突变如何影响三种主要抗 SARS-CoV 的图谱。 -2抗体结合。这些图确定了逃避抗体结合的突变，包括逃避再生元抗体混合物中两种抗体的单一突变。许多逃避单一抗体的突变正在人类中传播。
抗体是治疗严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 的潜在疗法，但尚不清楚该病毒的发展是否是为了逃避其风险。在这里，我们绘制了 SARS-CoV-2 受体结合域 (RBD) 中的所有突变如何影响 REGN-COV2 混合物与抗体 LY-CoV016 的结合。这些完整的图谱揭示了完全逃避 REGN-COV2 混合物的氨基酸突变，该混合物由针对不同结构表位的两种抗体 REGN10933 和 REGN10987 组成。这些数字还确定了在接受 REGN-COV2 治疗的持续感染患者中以及在体外病毒逃逸选择过程中选择的病毒突变。最后，这些数据表明，逃避单一抗体的突变已经存在于循环的 SARS-CoV-2 毒株中。这些完整的逃逸图可以解释病毒监测过程中观察到的突变的后果。
正在开发治疗严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 的抗体 (1)。针对某些其他病毒的抗体可能会因治疗受感染患者期间选择的病毒突变而变得无效 (2, 3) 或已在全球传播以赋予整个病毒进化枝抗性的病毒突变。因此，确定哪些 SARS-CoV-2 突变可以逃避关键抗体对于评估病毒监测期间观察到的突变如何影响抗体治疗的有效性至关重要。
大多数领先的抗 SARS-CoV-2 抗体都以病毒受体结合域 (RBD) 为靶点，该结构域介导与血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 受体的结合 (5, 6)。最近，我们开发了一种深度突变扫描方法，以绘制 RBD 的所有突变如何影响其功能和抗病毒抗体识别的情况 (7, 8)。该方法涉及创建 RBD 突变体文库，在酵母表面表达它们，并使用荧光激活细胞分选和深度测序来量化每个突变如何影响 RBD 折叠、ACE2 亲和力（在滴定系列中测量）和抗体结合（图S1A）。在本研究中，我们使用了（7）中描述的重复突变体库，该库由带有条形码的RBD变体组成，涵盖了3819个可能的氨基酸突变中的3804个。我们的文库是根据早期分离株Wuhan-Hu-1 的RBD 遗传背景制备的。尽管一些突变体的频率正在增加，但它们仍然代表最常见的 RBD 序列 (9, 10)。我们绘制了 2034 个突变中的两个，这些突变不会强烈破坏 RBD 折叠和 ACE 结合（7）如何通过 REGN-COV2 鸡尾酒（REGN10933 和 REGN10987）（11, 12）和礼来公司的 LY-CoV016 的重组形式抗体影响结合抗体（也称为 CB6 或 JS016）的方法 (13)（图 S1B）。REGN-COV2 最近获得了针对 COVID-19 的紧急使用授权 (14)，而 LY-CoV016 目前正在进行 3 期临床试验 (15)。
[Glu406→Trp(E406W)]强烈逃脱了两种抗体的混合物（图1A）。LY-CoV016 的逃逸图谱还揭示了 RBD 中不同位点的许多逃逸突变（图 1B）。尽管一些逃逸突变可能会损害 RBD 结合 ACE2 或以适当折叠形式表达的能力，但根据之前使用酵母展示的 RBD 进行深度突变扫描的测量，许多功能突变对这些功能特性影响很小或没有影响（7 ）（图1，A和B代表ACE2亲和力的丧失，而图S2代表RBD表达的减少。
(A) 绘制 REGN-COV2 中的抗体图谱。左侧的线图显示了 RBD 中每个位点的逃逸（每个位点所有突变的总和）。右侧的标志图像显示了强逃生位置（紫色下划线）。每个字母的高度与氨基酸突变介导的逃逸强度成正比，每个突变的“逃逸分数”为1对应于完全逃逸。每行的 y 轴刻度都不同，因此，例如，E406W 逃逸所有 REGN 抗体，但对于鸡尾酒来说最为明显，因为它被各个抗体的其他逃逸位点淹没。对于可扩展版本，S2、A 和 B 用于根据突变如何影响折叠 RBD 的表达来对图谱进行着色。S2、C 和 D 用于在循环病毒分离株中观察到的所有突变中分配对 ACE2 亲和力和 RBD 表达的影响。(B)如(A)所示，画出LY-CoV016。(C) 使用刺突假型慢病毒颗粒验证中和测定中的关键突变。我们选择验证循环中的 SARS-CoV-2 分离株（例如 N439K）中预计会产生更大影响或高频存在的突变。每个点代表突变的中值抑制浓度 (IC50) 相对于含有 D614G 的未突变野生型 (WT) 峰值的倍数增加。蓝色虚线1代表与WT类似的中和效果，值>1代表中和阻力增加。点的颜色表示您是否要逃离地图。点表示由于 IC50 超出所使用的稀释系列，因此检查倍数变化（上限或下限）。大多数突变体都会进行重复测试，因此有两点。完整的中和曲线如图2所示。S3．氨基酸残基的单字母缩写如下：A、Ala；C、半胱氨酸；D、天冬氨酸；E、谷氨酸；F、苯丙氨酸；G、甘氨酸；H，他的；我，岛；K、赖氨酸；L，刘；北大都市，阿森；P、临；Q、谷氨酰胺；R、精氨酸；S，Ser；T、苏氨酸；V，瓦尔；W，色氨酸；和Y，蒂尔。
为了验证关键突变的抗原作用，我们使用圆锥花序假型慢病毒颗粒进行了中和实验，发现抗体结合逃逸图谱与中和实验具有一致性（图1C和图S3）。正如REGN-COV2抗体图谱所预期的那样，486位的突变仅被REGN10933中和，而439和444位的突变仅被REGN10987中和，因此这些突变无法逃脱。但E406W逃脱了两种REGN-COV2抗体，因此它也强烈逃脱了混合物。通过结构分析和病毒逃逸选择，Regeneron 认为没有任何单个氨基酸突变可以逃脱鸡尾酒中的两种抗体 (11, 12)，但我们的完整图谱将 E406W 识别为鸡尾酒逃逸突变。E406W以相对特异的方式影响REGN-COV2抗体，并不会严重干扰RBD的功能，因为它仅轻微降低LY-CoV016的中和效果（图1C）和尖峰假型慢病毒颗粒的滴度（图S3F）。
为了探索我们的逃逸图谱是否与抗体选择下病毒的进化一致，我们首先检查了Regeneron病毒逃逸选择实验的数据，其中表达尖峰在任何REGN10933存在的情况下在细胞培养物中生长。口腔炎病毒 (VSV)、REGN10987 或 REGN-COV2 混合物 (12)。这项工作从 REGN10933 中鉴定出五个逃逸突变，从 REGN10987 中鉴定出两个逃逸突变，并且没有从鸡尾酒中发现突变（图 2A）。所有七种细胞培养物选择的突变都在我们的逃逸图中突出显示，并且Wuhan-Hu-1 RBD序列中野生型密码子的单核苷酸变化也是可访问的（图2B），表明逃逸之间的差异细胞培养物中抗体压力下的图和病毒进化。值得注意的是，E406W 无法通过单核苷酸变化来访问，这可能解释了为什么尽管 RBD 折叠和 ACE2 亲和力具有相对较好的耐受性，但 Regeneron 鸡尾酒选择仍无法识别它。
(A) 在存在抗体的情况下，Regeneron 使用圆锥花序假型 VSV 在细胞培养物中选择病毒逃逸突变 (12)。(B) 逃逸图，如图 1A 所示，但仅显示通过武汉-Hu-1 序列中的单个核苷酸变化可实现的突变。非灰色表示细胞培养物中的突变（红色）和受感染的患者（蓝色），或两者（紫色）。图 S5 显示了这些图，这些图根据突变如何影响 ACE2 亲和力或 RBD 表达而着色。(C) 在感染第 145 天接受 REGN-COV2 治疗的患者中 RBD 突变的动力学（黑色垂直虚线）。E484A 和 F486I 之间的连锁频率增加，但由于 E484A 在我们的图中不是逃逸突变，因此在其他图中没有显示。另请参见图。S4。(D) 细胞培养物和感染患者中发生的逃逸突变可通过单核苷酸接触，并且逃逸抗体的结合不会对 ACE2 亲和力造成任何重大损失 [通过酵母展示方法 (7) 测量]。每个点都是一个突变，它的形状和颜色表明它在病毒生长过程中是否可以被访问和选择。x 轴右侧点越多，表明抗体结合逃逸越强；y 轴上的点越高表示 ACE2 亲和力越高。
为了确定 Escape Atlas 是否可以分析感染人类的病毒的进化，我们检查了一名持续感染的免疫功能低下患者的深度测序数据，该患者在诊断出 COVID-19 治疗后第 145 天接受了 REGN-COV2 (16)。晚期治疗使患者的病毒种群积累遗传多样性，其中一些可能是由免疫应激驱动的，因为患者在治疗前具有较弱的自身中和抗体反应（16）。施用REGN-COV2后，RBD中五个氨基酸突变的频率迅速变化（图2C和图S4）。我们的逃逸图显示，其中三个突变逃逸了 REGN10933，一个逃逸了 REGN10987（图 2B）。值得注意的是，抗体处理后，并非所有突变都转移到固定位点。相反，竞争有起有落（图2C）。在其他病毒的适应性宿主的内部进化中也观察到了这种模式 (17, 18)，这可能是由于遗传搭便车和病毒谱系之间的竞争所致。这两种力量似乎在持续感染的患者中发挥着作用（图2C和图S4C）：E484A（在我们的图中不是逃逸突变）和F486I（逃逸REGN10933）在治疗后搭便车，而病毒谱系携带N440D和Q493K（分别逃逸REGN10987和REGN10933）首先与REGN10933逃逸突变体Y489H竞争，然后与携带E484A和F486I和Q493K的谱系竞争。
在 Regeneron 的病毒细胞培养物选择中未发现接受 REGN-COV2 治疗的患者的四种逃逸突变中的三种（图 2B），这说明了完整图谱的优势。病毒选择是不完整的，因为它们只能识别在特定细胞培养实验中随机选择的任何突变。相反，完整的图谱注释了所有的突变，其中可能包括与治疗无关的原因引起的突变，但却意外地影响了抗体结合。
当然，病毒的进化受到功能限制和逃避抗体压力的影响。细胞培养中选择的突变和患者始终满足以下标准：它们逃避抗体结合，可以通过单核苷酸变化进入，并且对 ACE2 亲和力几乎没有成本或没有成本[通过使用酵母扫描测量 RBD 显示的先前深度突变（7 ）]（图2D和图S5）。因此，突变如何影响 RBD 关键生化表型（例如 ACE 和抗体结合）的完整图谱可用于评估病毒进化的可能途径。需要注意的是，在较长的进化时间范围内，如在病毒免疫和药物逃逸中观察到的那样，由于上位相互作用，突变的耐受空间可能会发生变化 (19-21)。
完整的图谱使我们能够评估正在传播的 SARS-CoV-2 中现有的逃逸突变。我们检查了截至 2021 年 1 月 11 日所有可用的人源 SARS-CoV-2 序列，发现大量 RBD 突变逃脱了一种或多种抗体（图 3）。然而，唯一出现在>0.1%序列中的逃逸突变是REGN10933逃逸突变体Y453F[序列的0.3%；参见 (12)]，REGN10987 逃逸突变体 N439K [序列的 1.7%；参见图 1C 和 (22)]，以及 LY-CoV016 逃逸突变 K417N（0.1% 序列；另参见图 1C）。Y453F 与荷兰和丹麦水貂养殖场的独立爆发有关 (23, 24)；值得注意的是，水貂序列本身有时还包含其他逃逸突变，例如 F486L (24)。N439K 在欧洲非常流行，占欧洲苏格兰和爱尔兰序列的很大一部分 (22, 25)。K417N 存在于南非首次发现的 B.1.351 谱系中 (10)。当前关注的另一个突变是 N501Y，它存在于 B.1.351 中，也存在于最初在英国发现的 B.1.1.7 谱系中 (9)。我们的图显示 N501Y 对 REGN-COV2 抗体没有影响，但对 LY-CoV016 只有中等影响（图 3）。
对于每种抗体或抗体组合，截至 2021 年 1 月 11 日，在 GISAID 上的 317,866 个高质量人源 SARS-CoV-2 序列中（26），每个突变的逃逸分数与其频率之间的关系。它已被标记。REGN-COV2 鸡尾酒逃逸突变 E406W 需要 Wuu-Hu-1 RBD 序列中的多个核苷酸变化，而在 GISAID 序列中未观察到。低频计数观察到E406残基的其他突变（E406Q和E406D），但这些突变氨基酸并不是远离W的单核苷酸突变。
正如预期的那样，逃逸突变通常发生在抗体-RBD 界面中。然而，仅靠结构不足以预测哪些突变介导逃逸。例如，LY-CoV016利用其重链和轻链与与ACE2结合表面重叠的宽表位结合，但逃逸过程涉及重链互补决定区RBD残基的突变（图4A和图S6、E至G）。相反，REGN10933和REGN10987的逃逸主要发生在抗体重链和轻链界面处堆叠的RBD残基处（图4A和图S6，A到D）。逃逸 REGN-COV2 混合物的 E406W 突变发生在未与任一抗体接触的残基处（图 4，A 和 B）。虽然E406在结构上更接近LY-CoV016（图4B和图S6H），但E406W突变对抗体的影响要小得多（图1、B和C），表明具体的长程结构机制是抗REGN - COV2 抗体（图 S6I）。总之，与抗体接触的 RBD 残基的突变并不总是介导逃逸，一些显着的逃逸突变发生在不与抗体接触的残基处（图 4B 和图 S6、D 和 G）。
(A) 投射在抗体结合的 RBD 结构上的逃逸图。[REGN10933 和 REGN10987：蛋白质数据库 (PDB) ID 6XDG (11)；LY-CoV016：PDB ID 7C01 (13)]。抗体重链和轻链的可变结构域以蓝色卡通显示，RBD表面的颜色表示该位点突变介导的逃逸强度（白色表示没有逃逸，红色表示最强）抗体或混合物的逃逸位点）。未发生功能突变的站点呈灰色显示。(B) 对于每种抗体，将位点分类为直接抗体接触（抗体 4Å 内的非氢原子）、近端抗体（4 至 8Å）或远端抗体（> 8Å）。每个点代表一个站点，分为逃逸（红色）或非逃逸（黑色）。灰色虚线表示用于将站点分类为逃逸或非逃逸的临界值（有关详细信息，请参见材料和方法）。红色和黑色数字表示每个类别中有多少个网站已转义或未转义。
在这项研究中，我们完全绘制了逃避三种主要抗 SARS-CoV-2 抗体的突变图谱。这些图谱表明先前对逃逸突变的表征是不完整的。尚未发现可以逃避 REGN-COV2 混合物中两种抗体的单一氨基酸突变，也没有发现大多数接受混合物治疗的持续性感染患者。突变。当然，我们的图谱尚未回答最紧迫的问题：SARS-CoV-2 是否会对这些抗体产生广泛的耐药性？但可以肯定的是，令人担忧的是，如此多的逃逸突变对RBD折叠或受体亲和力几乎没有影响，而且循环病毒中已经存在一些低水平的突变。最后，还需要等待观察SARS-CoV-2在人群中传播时会传播哪些突变。我们的工作将通过立即解释病毒基因组监测分类的突变的影响来帮助“观察”。
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泰勒·N·斯塔尔 (Tyler N.Starr)、艾莉森·J·格里尼 (Allison J.Greaney)、阿明·阿迪提亚 (Amin Addetia)、威廉·W·汉农 (William W. Hannon)、马尼什·C·乔杜里 (Manish C. Choudhary)、亚当·S·丁格斯 (Adam S.
逃避再生元单克隆抗体混合物的 SARS-CoV-2 突变的完整图谱有助于解释病毒在治疗患者中的进化。
泰勒·N·斯塔尔 (Tyler N.Starr)、艾莉森·J·格里尼 (Allison J.Greaney)、阿明·阿迪提亚 (Amin Addetia)、威廉·W·汉农 (William W. Hannon)、马尼什·C·乔杜里 (Manish C. Choudhary)、亚当·S·丁格斯 (Adam S.
逃避再生元单克隆抗体混合物的 SARS-CoV-2 突变的完整图谱有助于解释病毒在治疗患者中的进化。
©2021 美国科学促进会。版权所有。AAAS 是 HINARI、AGORA、OARE、CHORUS、CLOCKSS、CrossRef 和 COUNTER.Science ISSN 1095-9203 的合作伙伴。
发布时间：2021年2月24日